2015, Vol. 30
尼日利亚菌素(Nigericin,CAS 28380-24-7)是一类等离子载体类抗生素，化学结构十分特殊，为拥有一个多环醚羧酸(polycyclic ether carboxylic acid)化合物，其作用主要是进行氢离子和钾离子的交换。尼日利亚菌素还对多种细菌具有抗性，如蜡状芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、酸热芽胞杆菌等[1, 2]，说明尼日利亚菌素在工业、农业、医学等方面有广泛的应用前景。尼日利亚菌素还具有较好的单独或协同其他药物抗耐药性菌[3]、抗病毒[4]和抑制肿瘤细胞[5]的作用。Han等[6]利用尼日利亚菌素作为抗病诱导剂；Kong等[7]利用尼日利亚菌素刺激线粒体研究K+传感器； Zhou等[8]利用尼日利亚菌素抑制上皮间质转化来抑制结肠直肠癌转移。
尼日利亚菌素是饱和型和K+载体聚醚类抗生素的代表[9]，它是一类次级代谢产物，并且生物合成途径已经阐明[10]。其合成涉及初级和次级代谢中的多种酶系[11]。尼日利亚菌素的微生物来源主要有，牛四文等[12]从海洋链霉菌的次生代谢物中发现尼日利亚菌素；卓锦明等[13]筛选到一株链霉菌产尼日利亚菌素能够抗MRSA，且具有免疫抑制活性；杨慧林等[14]发现放线菌Streptomyces sp.PRh5合成尼日利亚菌素，而且主要存在于胞外发酵液中。
芽胞杆菌在生物防治和治疗疾病方面具有很好的潜力，多种芽胞杆菌尤其是枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis在生长代谢过程中能够产生不同种类的抗菌物质，包括非核糖体合成的脂肽类抗生素lipopeptide antibiotics、生物表面活性素surfactin、丰原素fengycin和伊枯草菌素(iturin)等，具有广谱抑菌活性，在医药、饲料添加、微生态制剂等方面有重要应用[15]。本文采用液相色谱-四级杆飞行时间质谱(LC-QTOF-MS)技术对千叶短芽胞杆菌Brevibacillus choshinensis发酵液中活性成分进行研究，在其胞外代谢物中发现了尼日利亚菌素，即首次在芽胞杆菌中发现尼日利亚菌素。本文研究结果为进一步探索千叶短芽胞杆菌生理生化特征提供科学依据，并为尼日利亚菌素的来源提供了新的途径。
1 材料与方法 1.1 材料供试菌株：千叶短芽胞杆菌B.choshinensis FJAT-10008，从德国引进，现保存于福建省农业科学院农业生物资源研究所。培养基：活化培养基为NA培养基；种子培养基和发酵培养基均为TSB培养基(美国BD公司)。试剂：色谱纯乙腈(美国JT Baker公司)，色谱纯乙酸铵(CNW,上海安谱科学仪器有限公司)，色谱纯甲醇(美国JT Baker公司)。仪器：液相四级杆飞行时间质谱联用仪Agilent 1260/6520(美国安捷伦科技公司)；电子天平METTLER TOLEDO AL104(瑞士梅特勒·托利多仪器有限公司)；恒温培养振荡器智城ZHWY-2102C(上海智城分析仪器有限公司)；pH计Sartorius PB-10(德国赛托利斯公司)。
1.2 方法发酵液制备：将保存的千叶短芽胞杆菌(B.choshinensis FJAT-10008)菌株取出，采用平板划线法活化菌种。挑取单菌落，接种于TSB液体培养基中，于30℃、170 r·min-1条件下培养48 h。
样品制备方法：取芽胞杆菌发酵液，12 000 r·min-1离心10 min；离心后取上清液加入等体积冷甲醇(-20℃)，漩涡震荡混合。置于4℃冰箱15 min后，14 000 r·min-1离心10 min，取上清，0.22 μm滤膜过滤，4℃保存备用。
色谱质谱条件：色谱柱为Zorbax SB-Aq C18 2.1×100 mm，1.8 μm；柱温：30℃；进样量： 2 μL；流动相：A=10 mmol·L-1 乙酸铵+水，B=甲醇；流速：0.3 mL·min-1；梯度程序：0 min B=5%；8 min B=5%；38 min B=95%；45 min B=95%；47 min B=5%；55 min B=5%；MS运行条件：负离子模式；干燥气温度：350℃，干燥气流速5 L·min-1；Nebulizer 30 psig； Capillary voltage 3 500 V；Fragmentor 100 V；Skimmer 65.0 V；Mass range 100~3 000 m·z-1。MS运行条件：负离子模式。
2 结果与分析 2.1 千叶短芽胞杆菌FJAT-10008发酵液LC-MS物质成分分离千叶短芽胞杆菌FJAT-10008发酵液的总离子流图如图 1所示，共有1 246种物质，在Metlin数据库中检索初步鉴定206种，匹配得分(Score)高于80的共28个，见表 1。其中含量大于1%的有7种：(1)4-Oxoproline，相对含量为4.78%；(2)N,N-二乙基甘氨酸(N,N-Diethylglycine)，相对含量为3.35%；(3)Threonolactone，相对含量为2.6%；(4)His Arg His，相对含量为1.75%；(5)尼日利亚菌素(Nigericin)，相对含量为1.45%；(6)PA[14∶1(9Z)/17∶2(9Z,12Z)]，相对含量为1.39%；(7)PS[18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/22∶1(11Z)]，相对含量为1.31%。
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图 1 千叶短芽胞杆菌FJAT-10008发酵液的总离子流 Fig. 1 TIC of fermentation broth of B.choshinensis FJAT-10008 |
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表 1 千叶短芽胞杆菌B.choshinensis FJAT-10008发酵液高匹配成分 Tab.1 High-matching composition of fermentation broth from B. choshinensis FJAT-10008 culture |
千叶短芽胞杆菌FJAT-10008发酵液中尼日利亚菌素的化合物色谱图及离子色谱图如图 2、3所示，其保留时间为28.701 7 min，峰的相对丰度为1.96×105。尼日利亚菌素同位素峰结果见图 4，质谱图见图 5。其中同位素峰图提供了同位素峰的相对强度和同位素峰的间距。由于本试验采用负离子模式电离，负离子模式下产生的不同的分子离子，如[M+H]-、[M+X]-(X为所有溶剂或缓冲剂阴离子)等。故判断723.467 9峰为[M-H]-分子离子峰，推测该成分的质量数为724.467 9。根据所预测的分子式结果，同时参考同位素峰的相对强度和间距，以及Metlin库中匹配的分值，基本可以确定该成分为尼日利亚菌素，其结构如图 6所示。
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图 2 千叶短芽胞杆菌FJAT-10008发酵液中尼日利亚菌素化合物提取色谱 Fig. 2 Extracted compound chromatogram(ECC) of Nigericin in fermentation broth of B.choshinensis FJAT-10008 |
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图 3 千叶短芽胞杆菌FJAT-10008发酵液中尼日利亚菌素离子提取色谱 Fig. 3 Extracted ion chromatogram (EIC) of Nigericin in B.choshinensis FJAT-10008 |
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图 4 千叶短芽胞杆菌FJAT-10008发酵液中尼日利亚菌素同位素峰结果 Fig. 4 Isotopic peak of Nigericin in fermentation broth of B.choshinensis FJAT-10008 |
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图 5 千叶短芽胞杆菌FJAT-10008发酵液中尼日利亚菌素质谱 Fig. 5 Mass spectrum of Nigericin in fermentation broth of B.choshinensis FJAT-10008 |
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图 6 尼日利亚菌素的结构 Fig. 6 Structure of nigericin |
已报道千叶短芽胞杆菌的研究主要是集中在其作为表达载体上。如Tanio等[16]以千叶短芽胞杆菌为M-无花果酶的表达载体；Cheng等[17]以千叶短芽胞杆菌为人类三叶肽活性表达的载体；Mizukami等[18]发现千叶短芽胞杆菌能高效表达VHH抗体片段；Mu等[19]发现千叶短芽胞杆菌作为寄主能够解决基质金属蛋白酶26在大肠杆菌表达时的不水溶和活性差的问题； Tokunaga等[20]通过新型融合技术使千叶短芽胞杆菌分泌单链抗体。
在其代谢产物方面，Tanio等采用15N标记法[21]和氨基酸标记法[22]对千叶短芽胞杆菌分泌的蛋白进行研究。已报道千叶短芽胞杆菌的分泌蛋白有胞浆蛋白[23]、维生素B2-结合蛋白[242]、硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶[25]等。本试验通过LC-QTOF-MS技术也分析出在千叶短芽胞杆菌发酵液中存在着较多的氨基酸成分，如相对含量大于1 %的化合物中包含有氨基酸类物质如4-Oxoproline、N,N-Diethylglycine和PA，还有三肽如His Arg His。除了氨基酸成分外，在千叶短芽胞杆菌发酵液中的活性物质，本试验检测到相对含量大于1 %的化合物中还有两类物质，包括酯类的Threonolactone和PS以及醚类的尼日利亚菌素Nigericin。
芽胞杆菌产生的抑菌物质中最常见的一类是由非核糖体途径合成的脂肽类抗生素[26]。本试验菌株千叶短芽胞杆菌发酵液中的活性成分尼日利亚菌素是一类聚醚类抗生素，大多数聚醚类抗生素能通过形成亲脂混合物携带1价离子穿过生物膜[27]，能抑制危害家禽的球虫病，提高反刍动物的饲料转化率，有显著的经济效益[28]。而我们首次从千叶芽胞杆菌的胞外物质中发现了尼日利亚菌素，说明千叶短芽胞杆菌具有较强的尼日利亚菌素外排能力，值得进一步开发应用，且本研究为千叶短芽胞杆菌来源的多醚类抗生素的开发与利用提供了理论依据。
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