文心兰Oncidium又名舞女兰、金蝶兰、瘤瓣兰等，是重要的盆切花经济栽培品种。文心兰易患软腐病，在组培苗的移栽阶段，软腐病更能带来毁灭性的打击。目前，该病没有特别有效的防治方法，因此选育抗软腐病文心兰品种的是文心兰育种的重要课题。文心兰可以进行广泛的属内杂交和属间杂交，但无论属内杂交还是属间杂交其亲和力都差，在自然条件下结果较为罕见^{[1, 2]}，难以利用传统的育种方法改变某些品种的单一性状，因而利用转基因技术快速提升文心兰经济栽培性状成为文心兰育种的重要手段^{[3, 4, 5, 6, 7, 8]}。

铁氧还蛋白 (Ferredoxin,Fd)在光合电子传递链PSI中参与NADP的再生，是卡尔文循环及细胞内活性氧 (reactive oxygen species,ROS)水平调控的关键蛋白^[9]。现已知源自甜椒的类植物铁氧还蛋白(plant like ferredoxin protein,PFLP)具有提高植物对抗多种生物及非生物胁迫的生理作用^{[10, 11, 12]}，但值得注意的是，并非超表达所有类型的铁氧还蛋白均具有此能力，铁氧还蛋白在植物中以基因家族的形式存在，依据其光合作用的特性(光合类型及非光合类型)^[13]及亚细胞定位(叶绿体型及非叶绿体型)^[14]，不同成员的生理功能均有巨大的差异^[15]，超表达Fd2基因可能造成植物生长缓慢、产量减少^[16]。本研究以文心兰PLB为受体材料，通过根癌农杆菌介导法，利用此前获得的龙眼Dimocarpus longan 2个非光合Fd家族基因Fd3(JF733784)、FdC1(JF95856)^[17]导入文心兰，并进行一系鉴定与分析，以期了解不同类型Fd基因在提高抗病能力方面的差异，并获得具有较高抗病能力的文心兰转化植株。

文心兰品种为南茜(Onc. ‘Gower Ramsey’)，以继代培养35 d文心兰PLB为转化受体材料。

根据龙眼2个不同类型非光合类型铁氧还蛋白基因设计带限制性内切酶位点BglII、SpeI的上下游相应ORF引物，两端设保护性碱基，分别为FdC1 BglII: GGA AGATCT ATGAACCTTC TTCTTCCCTCCA，FdC1 SpeI:GG ACTAGT ATTCATCACC CATGGCTAACTC；Fd3 BglII：GGA AGATCT ATGGCAACTG TGACCCTTAG，Fd3 SpeI:GG ACTAGT GTAAAGTTCG CCTTCCTTGT G。进行PCR扩增并回收片段，导入PMD18-T(TAKARA)构建PMD18-T-FD质粒。利用Fermentas FastDigest (Thermo Fisher Scientific) 限制性内切酶Bgl II、Spe I双酶切pCAMBIA1302及PMD18-T-FD质粒，回收酶切质粒及500 bp左右小片段，利用T4连接酶将龙眼非光合类型Fd导入pCAMBIA1302(p1302)，构建p1302∷FD(X)质粒,构建好的质粒经PCR检测，导入大肠杆菌感受态DH5α(天根)，阳性菌株送华大基因测序，检测剪接正确性，完成双元表达载体p1302∷FD(X)的构建(图 1)。

为筛选适宜的潮霉素筛选培养浓度，以继代培养35 d 文心兰PLB 为材料，分别接种于含3、5、8 mg·L^-1潮霉素MS培养上，每瓶接种20粒PLB，每个处理接种5瓶，重复3次，45 d 后观察PLB生长结果。

参照Liau等^[3]的方法，以继代35 d PLB为培养材料，将PLB接种于含0.5 mol·L^-1蔗糖，100 μmol·L^-1乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)的MS液体培养基，置于80 RPM摇床，高渗处理2 h，再通过3 d黑暗条件下固体MS培养基预培养；将预处理后PLB材料置于OD₆₀₀值为0.8的农杆菌EHA105及LBA4404菌液(添加AS浓度至100 μmol·L^-1)进行侵染30 min，接种于MS培养基黑暗条件下共培养3 d，并转移至含50 mg·L^-1头孢MS培养基，25℃、16 h·d^-1光照进行二阶共培养；15 d二阶共培养后转入含5 mg·L^-1潮霉素筛选培养基,25℃、16 h·d^-1光照，进行2次周期为45 d的筛选培养,侵染不同品种农杆菌的PLB以每瓶接种20粒的方式接种5瓶，重复3次，90 d后统计所产生的抗性PLB及芽数量；将抗性芽转入普通生根培养基培养60 d，移栽至水草待测。

参照江金兰等的方法^[18]，采用CATB法提取转化后文心兰叶片基因组DNA，参照Ye等的方法^[19]，采用Pine free法提取RNA，PrimeScript逆转录试剂盒(TAKARA)合成cDNA，通过各自的ORF特异引物PCR检测目的基因条带验证T-DNA是否导入植株。

参照尹俊梅等的方法^[20]，选取文心兰软腐病病叶，75%乙醇表面灭菌后挑取病健结合部组织液于NA固体培养基划板，挑取的单菌落于NA液体培养基置于摇床，28℃、250 r·min^-1，摇菌过夜，挑取有致病力菌液用于抗病性检测。具体步骤为，利用10 μL 枪头蘸取菌液，于假鳞茎打孔，以不穿透假鳞茎为度，接种10 dpi(days post innoculated)观察统计抗病指数，20 dpi观察统计成活率，以接种NA培养基的野生型植株为对照，每个处理接种10株，重复3次。抗病指数的统计参照尹俊梅等^[20]的方法。为保证试验的准确性，分别以阳性Fd3及FdC1的组培后代苗为材料进行试验。

利用龙眼Fd3(JF733784)、FdC1(JF957856)含Bgl II及Spe I限制性内切酶位点的特异性引物从龙眼cDNA克隆序列全长并通过双酶切导入pCAMBIA1302质粒相应位点，构建双元表达载体(图 1)，所构建载体导入PMD18-T，挑选单克隆测序无误后，提取质粒，导入农杆菌EHA105及LBA4404，挑取抗性单克隆，PCR验证阳性条带备用。

图 1 p1302∷FdX∷MGFP5植物表达载体构建 Fig. 1 Construction of pCAMBIA1302∷DlfdX∷MGFP5 vector

为确定转化后的筛选培养适宜的潮霉素，以继代培养35 d 文心兰PLB 为材料，分别接种于含3、5、8 mg·L^-1潮霉素MS培养上，45 d 后观察PLB生长结果(图 2)。由图可知，在含在潮霉素培养基的PLB生长速度显著放慢，但含3 mg·L^-1潮霉素培养中，文心兰PLB仅现少量白化，PLB仍能保持缓慢生长及分化，分化苗不坏死；在含5 mg·L^-1潮霉素培养中，PLB生长停滞并白化，仅存少量淡绿色PLB，分化苗白化坏死；8 mg·L^-1潮霉素下，PLB褐变并坏死，分化苗白化。鉴于高浓度潮霉素易导致PLB难以分化，故5 mg·L^-1潮霉素适宜用于文心兰PLB筛选培养。

图 2 文心兰PLB在不同质量浓度潮霉素培养基培养效果 Fig. 2 Growth of Oncidium PLBs on media containing varied amounts of hygromycin 注：A~D分别为添加潮霉素质量浓度0、3、5、8 mg·L-1。

文心兰PLB在LBA4404与EHA105侵染3个月后，二者在转化效率上表现较为显著的差异(图 3)。EHA105产生的抗性PLB数量为LBA4404的2.48倍。分化能力方面LBA4404侵染的PLB表现分化迟缓，PLB分化率仅为11.1%，而EHA105侵染的PLB表现较强的芽分化能力，分化率为47.8%。因此，使用EHA105作为文心兰基因转化农杆菌能显著提高转化效率，并提高抗性培养后PLB分化能力。

图 3 不同农杆菌菌株对文心兰PLB的转化效率影响 Fig. 3 Effect of Agrobacterium strains on efficiency of gene transfer to Oncidium PLBs 注：A为LBA4404菌株侵染结果；B为EHA105菌株侵染结果。

利用农杆菌EHA105，分别将含龙眼Fd3及FdC1基因导入文心兰PLB。抗性培养3个月后，检测外源基因的导入情况。经抽取DAN，各自ORF特异性引物检测结果(图 4-A)表明，转Fd3基因的侍测株有6棵植株在450 bp左右有阳性条带，转FdC1基因的11株侍测株有8棵植株在500 bp左右有阳性条带。为了进一步确认外源基因是否已导入文心兰PLB，将阳性及OeFdC进行RNA水平的检测(图 4-B)，2个不同类型基因均获得特异性扩增，且相应对照(WT)均表现在阴性，表明外源基因已导入基因组。

图 4 转化文心兰植株PCR阳性检测 Fig. 4 Positive PCR test on transferred Oncidium seedlings 注：①A为基因组DNA检测图；B为DNA水平检测图；②oeFd3：超表达Fd3；oeFdC1：超表达FdC1；WT：野生型。

参照尹俊梅等^[20]的方法，统计发病指数。经对比发现，与野生型植株相比，野生型植株与转化植株在形态上无显著差异，但转Fd3基因植株抵抗软腐病能力提高，由高感软腐病(Di=100)提升为中抗软腐病(Di=27.5)(图 5)，移栽成活率由79.3%提高至95.7%(图 6),均达极显著差异水平，但转化Fdc1植株在抗软腐病方面及移栽成活方面均与野生型植株无显著差异。

图 5 转化文心兰抗软腐病分析 Fig. 5 Resistance to soft rot of transferred Oncidium 注：A为野生型植株接种软腐病菌；B为超表达FdC1植株接种软腐病菌；C为超表达Fd3植株接种软腐病菌；D为野生型接种NA琼脂块；E为野生型植株移栽效果；F为超表达FdC1植株移栽效果；G为超表达Fd3植株移栽效果。

图 6 转化文心兰抗病性分析 Fig. 6 Disease-resistance of transferred Oncidium 注：①oeFd3-超表达Fd3文心兰植株；oeFdC1-超表达FdC1文心兰植株；WT-野生型文心兰植株；②*代表P<0.05，**代表P<0.01。

本研究利用潮霉素作为筛选标记基因可以建立高效的文心兰PLB基因转化系统。潮霉素和卡那霉素是兰花转基因中应用较多的筛选标记基因，使用5 mg·L^-1的潮霉素和200 mg·L^-1卡那霉素都可以完成转化后PLB的筛选^[21]。此前的试验中，在文心兰PLB潮霉素的筛选转化效率为9%~12%，卡那霉素则低于5%，而甘露糖为21%^[8]。在本试验中，抗性PLB在潮霉素培养基中的获得率为33.5%，抗性苗获得率为10.5%，潮霉素筛选系统是较为有效的文心兰转化筛选物。

此外，长期高浓度的抗生素可能导致植株再生能力的下降的现象^[21]，在本试验中仅在LBA4404的农杆菌中出现，EHA105转化的PLB能保持较高的分化能力。

本试验利用两种不同类型的农杆菌均得到了抗性PLB及分化植株EHA105效果显著优于LBA4404。 兰花常用的基因转化农杆菌主要有EHA105、LBA4404，也有少数报道将AGL0、AGL1用于比较，但后两者转化效果不佳^[6]。EHA105可能在转化后PLB的芽分化方面较LBA4404的效果要好，在将香水文心兰(Onc.‘Sharry baby’)筛选后的PLB进行芽分化培养时，EHA105转化的58个原球茎中分化22个芽，而LBA4404部分仅在50个PLB中分化6个芽，这一点与本试验的结果较为一致。

源自甜椒的Fd蛋白Pflp已被发现能在水稻、烟草及拟南芥等的多种转化植株中产生广谱抗性^{[22, 23]},并被应用于文心兰及蝴蝶兰的抗软腐病的转基因育种研究^{[21, 24]}。其中软腐病由欧文氏杆菌Erwinia carotovora所诱导，是能给兰科植株带来毁灭性的病害之一。2003年，Liau等^[3]通过农杆菌将pflp导入文心兰，发现在转化植株中，叶片在接种后水渍化现象显著下降，相应的病原物繁殖系数降低，表明转化pflp能对文心兰对抗软腐病带来帮助。

在拟南芥及其他物种的研究可知，Fd基因以基因家族的形式存在，不同类型的Fd蛋白的物理化学特性并不一致^[13]。Pflp编码光合类型的Fd基因，Pflp的抗性产生可能源自ROS调控及细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)作用的激活^[25]。尽管Fd蛋白已在多种植株的抗病育种中得到应用，但现已知由于Fd蛋白在逆境下存在不稳定的特性，超表达Fd基因对植物抗病的机理方面仍存一定的争议。Ceccoli等将蓝藻Fd基因导入烟草，观察是否转蓝藻Fd基因的烟草也同转化黄素氧黄蛋白(flavodoxin,fld)一样表现使植株的抗性增强，结果发现，外源Fd基因在冷害等逆境下的降解速度高于内源Fd基因，并且不会使植株产生抗逆境的能力^[26]。上述结果表明，不同类型的Fd基因在抗逆境的生理过程中可能扮演不同的角色，本试验通过将两种不同类型的Fd基因导入文心兰，发现仅转化Fd3基因使植株抵抗软腐病能力提高，但转化FdC1植株与野生型植株无显著差异，虽然二者均可能归属为非光合类型的Fd蛋白^[16]。由于Fd蛋白参与光合电子传递，其电化学性质可能与其在转化后抗病能力的ROS调控及PCD激活中起重要作用^{[22, 23]}，转化植株抗病能力的差异可能与Fd3具有更强的电子还原能力^[27]，而FdC1仅参与电子传递而不参与还原NAPH⁺有关^[28]。由于FdC1是近年才发现的Fd家族新成员^[28]，有关其在植物的生理作用报道仍较少，该基因与Fd3在产生抗病能力差异方面的机理还有待进一步研究。

本研究通过转化龙眼不同类型的Fd蛋白于文心兰，发现转化Fd3基因类型植株具有较强的抗病能力，本研究结果将为培育兰科抗性品种提供新的基因资源。此外，由于不同Fd蛋白在抗病机理方面还存在争议，转化龙眼Fd3基因类型植株将为解决此科学问题提供新的参考。