鸭疫里默氏杆菌Riemerella anatipestifer(RA)感染又称为鸭传染性浆膜炎，是雏鸭的一种急性或慢性传染病。该病给全球养鸭业造成巨大的经济损失，已成为危害养鸭业的主要细菌性传染病之一。

鸭疫里默氏菌的致病性与毒力因子密切相关。除了已确定的外膜蛋白A(OmpA) ^[1]、载铁体相互作用蛋白(SIP)^[2]等毒力因子外，还预测了一些潜在的毒力因子。 Zutao Zhou 等^[3]预测了鸭疫里默氏菌中的枯草杆菌素样蛋白酶(subtilisin-like serine protease，sspA) 可能是毒力相关因子。SSPA基因编码的蛋白位于细胞表面，是一种枯草杆菌素样蛋白酶，它与链球菌感染中黏附入侵细胞的重要毒力因子的C5a蛋白酶具有很高的同源性。本研究通过对鸭疫里默氏菌SSPA基因进行克隆和生物信息学分析，以期为进一步研究其生物学功能奠定理论基础。

鸭疫里默氏菌RA-1 (血清 1 型)、RA-2 (血清 2 型) 、RA-6 (血清 6 型) 、 RA-10 (血清 10 型) 、RA-11 (血清 11 型) 与 RA-17 (血清 17型) ，均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定并保存。

pMD18-T 载体、DNA Maker 购自宝生物 (大连)工程有限公司；EasyPure Bacteria DNA Kit、2×Trans Taq-T PCR SuperMix、大肠杆菌 DH5α 感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司； 胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒购自 Omega 公司。其他试剂均为分析纯。

参照GenBank登录的SSPA基因序列，利用Oligo 7.0 设计引物包含 SSPA基因的ORF。引物序列为：sspA-F1：5′- AAAGTCGGTATTATATTAAGT- 3′； sspA-R1：5′- ATAAAAAGGTTGCCTCATCTG -3′，预期扩增片段大小为1 825 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

按照EasyPure Bacteria DNA Kit 的说明书分别提取6个血清型的鸭疫里默氏菌 DNA作为模板，用所设计的引物进行 PCR 扩增，扩增体系为 50 μL，其中 2×Mix 25 μL、上下游引物(20 μmol·mL^-1)各1 μL、cDNA 1 μL、补充去离子水至 50 μL。反应条件：94℃预变性 5 min 后进入循环，循环参数为 94℃ 50 s，53℃ 35 s，72℃ 2 min，35 个循环后，72℃ 延伸 10 min。反应结束后，用 1.0% 琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳。将 PCR 产物经胶回收试剂盒回收纯化后与 pMD18-T 载体连接，转化 DH5α感受态细胞，用 PCR 法鉴定重组质粒，从每个血清型的阳性质粒中随机挑取3个送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

SSPA基因核苷酸与氨基酸序列分析 通过NCBI BLAST 在线软件验证测序结果，使用 Lasergene v7.0 DNAStar 软件对测序结果进行拼接，获得鸭疫里默氏菌 SSPA基因的完整的核苷酸序列，推导其氨基酸序列，分析其基本的特征。应用DNAStar ( Protean)软件预测可形成抗原表位的氨基酸区域。

应用在线分析软件SignalP V4.0 World Wide Web Server 预测其信号肽位点；应用TM-HMM Server V.2.0预测其跨膜区；应用NetNGly c1.0(http：/ / www.cbs. dtu. dk/ services/ NetNGlyc)预测其N-糖基化位点；应用YinOYang 1.2( http: / / www .cbs. dtu. dk/ services/ ) 预测其O-糖基化位点；应用NetPhos2.0(http: / / www . cbs. dtu. dk/ services/ NetPhos/ ) 预测磷其酸化的位点。

将所测的6个血清型的鸭疫里默氏菌 SSPA基因和 GenBank 已发表的鸭疫里默氏菌 SSPA基因进行核苷酸序列及氨基酸序列比对，并绘制其遗传进化树。

利用所设计的特异性引物对6个血清型 鸭疫里默氏菌的 DNA 进行扩增，结果(图 1)显示：所扩增的片段大小均为 1825 bp，与预期目的片段相符。

图 1 鸭疫里默氏菌 SSPA基因的 PCR 扩增 Fig. 1 PCR product of RA SSPA gene 注：1～6分别为RA-1、RA-2、RA-6、RA-10、RA-11、RA-17；M为DL-2000。

根据 NCBI BLAST 在线软件验证测序结果，使用Lasergene v7.0 DNAStar 软件对测序结果进行拼接，获得鸭疫里默氏菌SSPA基因的完整的核苷酸序列，其长度为1 692 bp，编码 563 个氨基酸，所编码蛋白的大小为 62.7 Ku，等电点为 6.39。

使用DNAStar 预测该蛋白的抗原性。根据有关指数与表位形成的关系，当亲水性位点>0、抗原指数>0、表面可及性>1 时，形成表位的可能性较大^[4]。结果表明，鸭疫里默氏菌 SSPA基因编码的氨基酸可形成多个抗原表位(图 2) ，推测该蛋白应具有较强的免疫原性。

图 2 SSPA基因的亲水性、表面可及性和抗原性预测 Fig. 2 Prediction of hydrophilicity，surface probability and antigenicity of SSPA gene

应用SignalPV4.0 World Wide Web Server 进行信号肽切割位点预测，预测结果(图 3) 表明，其信号肽切割部位位于第19 位的 A (丙氨酸) 和第 20 位的 Q(谷氨酰胺) 氨基酸之间。TM-HMM 软件的预测结果表明，SSPA 蛋白没有跨膜区。当预测软件NetNGlyc1.0、YinOYang 1.2与NetPhos2.0的阈值取0.5 时，SSPA蛋白含有1 个潜在的N-糖基化位点、1个潜在的O-糖基化位点和38 个潜在的磷酸化位点(包括12 个丝氨酸、9个苏氨酸和17个酪氨酸位点)。

图 3 鸭疫里默氏菌SSPA基因的信号肽预测 Fig. 3 The prediction of signal peptide of RA SSPA gene

应用 Lasergene v7.1 DNAStar 软件将克隆测序的6个血清型鸭疫里默氏菌 与 GenBank 登录的鸭疫里默氏菌SSPA 基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性比对分析，6 种血清型的鸭疫里默氏菌与 GenBank 中登录的鸭疫里默氏菌 CH3 株(CP006649)、RA-CH-1 株(CP003787)、RA-CH-2株(CP004020)、RA-GD株(CP002562)的 SSPA 基因的核苷酸序列同源性为95.7%~100%(表 1)；其氨基酸序列同源性为98.2%~100%，其中同为血清 1 型的 CH3株、RA-CH-1 、RA-GD株与RA-1株的核苷酸同源性为95.7%~100%，同为血清2型的RA-CH-2株与 RA-2株的核苷酸同源性为100%，而血清1型的CH3株、血清6型的RA-6与血清10型的RA-10的核苷酸同源性均为100%。该比对结果表明鸭疫里默氏菌不同菌株之间SSPA基因的同源性很高，是相对保守的基因，且该基因同源性的高低与血清型无关。

表 1(Tab.1)

表 1 几种血清型 RA 菌株SSPA基因序列的同源性分析 Tab.1 Homology annlysis of SSPA gene from several serotype RA strains (单位/%) 注：1～10分别为CH3(血清1型)、RA-CH-1(血清1型)、RA-CH-2(血清2型)、RA-GD(血清1型)、RA-1(血清1型)、RA-2(血清2型)、RA-6(血清6型)、RA-10(血清10型)、RA-11(血清11型)、RA-17(血清17型)。 菌株 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 - 100.0 95.7 95.7 100.0 95.7 100.0 100.0 95.7 95.7 2 0.0 - 95.7 95.7 100.0 95.7 100.0 100.0 95.7 95.7 3 4.4 4.4 - 100.0 95.7 100.0 95.7 95.7 99.9 100.0 4 4.4 4.4 0.0 - 95.7 100.0 95.7 95.7 99.9 100.0 5 0.0 0.0 4.4 4.4 - 95.7 100.0 100.0 95.7 95.7 6 4.4 4.4 0.0 0.0 4.4 - 95.7 95.7 99.9 100.0 7 0.0 0.0 4.4 4.4 0.0 4.4 - 100.0 95.7 95.7 8 0.0 0.0 4.4 4.4 0.0 4.4 0.0 - 95.7 95.7 9 4.5 4.5 0.1 0.1 4.5 0.1 4.5 4.5 - 99.9 10 4.4 4.4 0.0 0.0 4.4 0.0 4.4 4.4 0.1 -

表 1 几种血清型 RA 菌株SSPA基因序列的同源性分析 Tab.1 Homology annlysis of SSPA gene from several serotype RA strains

利用 DNAStar 软件把克隆测序的鸭疫里默氏菌与 GenBank 登录的鸭疫里默氏菌的 SSPA 基因序列进行遗传进化分析(图 4)。由图可知，RA-GD株、RA-11株、RA-2株、RA-17株与RA-CH-2株在遗传进化上处于同一分支；而RA-10株、RA-CH-1株、RA-6株、RA-1株与CH3株则处于另一分支。

图 4 鸭疫里默氏菌SSPA基因遗传进化分析 Fig. 4 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of SSPA gene

枯草杆菌素能降解肽和多肽，是由革兰氏阳性细菌产生的一类丝氨酸蛋白酶类，具有类似于胰蛋白酶细胞外酶类的作用。链球菌属中的C5a肽酶，是一种枯草杆菌素类蛋白酶，它通过切割补体系统的一个组分来逃避宿主的吞噬，已证实是 A 群和 B 群链球菌保守的毒力因子^{[5, 6, 7, 8, 9]}。Zutao Zhou 等^[3]通过对鸭疫里默氏杆菌 YM 株基因组序列的分析，发现了SSPA基因编码的氨基酸与链球菌属的 C5a 蛋白酶具有很高的同源性，是一种位于细胞表面的枯草杆菌蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶，并预测了SSPA可能是鸭疫里默氏菌潜在的毒力相关因子。

本研究成功地克隆了 6 种血清型鸭疫里默氏菌的 SSPA基因，该基因全长1 692 bp，编码了563 个氨基酸，包含1个完整的开放阅读框。对 SSPA 蛋白进行抗原性分析，发现了鸭疫里默氏菌SSPA基因编码的氨基酸可形成多个抗原表位，推测该蛋白应具有较强的免疫原性。对SSPA蛋白的信号肽切割位点分析可知，该蛋白信号肽切割部位位于第19 位的 A (丙氨酸) 和第 20 位的 Q(谷氨酰胺) 氨基酸之间。通过对该蛋白的跨膜区、N-糖基化位点、O-糖基化位点及磷酸化位点进一步分析，发现该蛋白没有跨膜区，含有1 个潜在的N-糖基化位点、1个潜在的O-糖基化位点，38 个潜在的磷酸化位点(包括12 个丝氨酸、9个苏氨酸和17个酪氨酸位点)。通过与 GenBank中登录的其他 RA 株SSPA基因进行同源性比对分析，6 种不同血清的SSPA基因的核苷酸同源性为95.7%~100%，氨基酸同源性为98.2%~100%。遗传进化分析，分属于6种血清的 10 株(包含Genbank中的4株)鸭疫里默氏菌SSPA基因被分为两大分支。由此推测 SSPA 基因可能存在于各个血清型的鸭疫里默氏菌中，属于较为保守基因，且该基因同源性的高低与血清型无关。