随着人们对食用菌药用价值和营养价值认识的提高，优良的食用菌品种受到人们的广泛关注，食用菌育种工作始终是专家关注的热点之一。近年来，以原生质体分离为基础的原生质体技术育种在品种改良方面有了突出的进展^{[1, 2, 3, 4, 5]}，原生质体技术是利用原生质体诱变、杂交、转基因等培育变异新类型的生物技术^[6]，而新品种的产生都是通过原生质体的再生来实现的，因此，原生质体的再生尤其重要，是原生质体技术得以应用的基本前提。杏鲍菇Pleurotus eryngii Quel别名剌芹侧耳，隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，营养丰富，适应性强，生物效率高，近年来世界各地都有大量栽培^[7]，本研究对杏鲍菇原生质体再生条件进行了初步探索，以期为今后原生质体技术在杏鲍菇育种中的应用提供一定的参考依据。

杏鲍菇pl.e 0091，由福建农林大学菌物研究中心提供。

PDA培养基，稳渗剂(0.6 mol·L^-1)。

20%杏鲍菇子实体浸提液，琼脂1.8%，稳渗剂(0.6 mol·L^-1)。

麦芽糖0.5%，酵母膏0.5%，葡萄糖1%，VB₁0.003%，琼脂1.8%，稳渗剂(0.6 mol·L^-1)。

土豆10%，酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖2%，KH₂PO₄0.2%，MgSO₄·7H₂O 0.1%，VB₁0.001%，琼脂1.8%，稳渗剂(0.6 mol·L^-1)。

琼脂含量为1.1%的MYG再生培养基。

不含琼脂的PDA再生培养基。

试验所用溶壁酶购自广东省微生物研究所，试验所用稳渗剂(NaCl、KCl、MgSO₄、甘露醇、蔗糖)购自国药集团化学试剂有限公司，1%中性红染液(甘露醇0.6 mol·L^-1)。

原生质体的制备方法(包括菌丝的培养与收集、酶液及稳渗液的配制、酶解反应终止、原生质体纯化、原生质体的计数等)参见朱坚等的方法^[8]。

吸取10 μL原生质体悬液于载玻片上，再滴加20 μL中性红染液，20 min后镜检，不着色的原生质体具有活性，反之则失活。

将纯化的原生质体悬液用甘露醇(0.6 mol·L^-1)稀释至10⁵个·mL^-1左右，分别吸取100 μL进行培养：(1)单层平板培养，即直接涂布于PDA再生培养基上，25℃恒温避光培养6 d；(2)双层平板培养，即先与半固体再生培养基混匀(39℃)再倾注于PDA再生培养基上，25℃恒温避光培养6 d；(3)液体-固体平板培养，即先转接于液体再生培养基25℃静置培养2 d，再将其全部涂布于PDA再生培养基上，25℃恒温避光培养4 d。计数再生菌落。

在酶液的配制、酶解反应的终止、原生质体悬液的稀释及再生培养基配置时，分别以NaCl(0.6 mol·L^-1)、KCl(0.6 mol·L^-1)、MgSO₄(0.6 mol·L^-1)、甘露醇(0.6 mol·L^-1)、蔗糖(0.6 mol·L^-1)为稳渗液，原生质体稀释至10⁵个·mL^-1左右，吸取100 μL进行单层平板(PDA再生培养基)培养，25℃恒温避光培养6 d。计数再生菌落。

将稀释至10⁵个·mL^-1左右的原生质体悬液100 μL分别涂布于以下4种不同的再生培养基中：PDA再生培养基、子实体浸提液再生培养基、MYG再生培养基、酵母粉蛋白胨再生培养基，25℃恒温避光培养6 d。计数再生菌落。

分别以静置培养3、5、7、9、12 d的菌丝为材料，进行原生质体的制备，纯化并稀释至10⁵个·mL^-1左右后吸取100 μL涂布于MYG再生培养基上，25℃恒温避光培养6 d。计数再生菌落。

Pl.e 0091原生质体制备体系参见张鹏等^[9]的方法，分别对酶含量、酶解时间、酶解温度设置不同梯度，酶含量：1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%； 酶解时间：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h；酶解温度：23、26、29、32、35℃进行单因素试验。原生质体纯化、稀释至10⁵个·mL^-1左右吸取100 μL直接涂布于MYG再生培养基上，25℃恒温避光培养6 d。计数再生菌落。

再生率(%)=(纯化后再生菌落数-无菌水稀释后再生菌落数)/ 原生质体总数×100%，由于原生质体纯化时未过滤除掉的菌丝片段再生形成菌落会产生误差，因此要用无菌水稀释涨破原生质体做对照。

刚制备得到的原生质体经染色后未发现着色的原生质体，得到的原生质体都具有活性。

原生质体3种方式培养结果(图 1、表 1)表明，原生质体经不同方式培养后的再生率差异达到显著水平(P<0.05)，说明不同的再生方式对原生质体的再生率有显著影响。多重比较结果(表 2)表明液体-固体平板培养的原生质体再生率(0.84%)比单层平板培养和双层平板培养的原生质体再生率(0.51%、0.55%)分别提高了0.33和0.29个百分点，差异达到显著水平(P<0.05)，而单层与双层平板培养原生质体再生率之间差异不显著(P>0.05)。

图 1 不同方式培养原生质体结果 Fig. 1 Protoplast regeneration by various methods 注：A为单层平板培养，B为双层平板培养，C为液体-固体平板培养，D为对照。

表 1(Tab.1)

表 1 原生质体3种培养方式再生率的方差分析 Tab.1 Analysis of variance on protoplast regeneration rates for 3 culturing methods 注：F0.05(2,15)= 3.68，F0.01(2,15)=6.35。 SS Df MS F Sig. 组间变异 0.402533 2 0.201267 5.13159 0.020046 组内变异 0.588317 15 0.039221 总变异 0.99085 17

表 1 原生质体3种培养方式再生率的方差分析 Tab.1 Analysis of variance on protoplast regeneration rates for 3 culturing methods

表 2(Tab.2)

表 2 原生质体不同培养方式再生率的多重比较(SSR法) Tab.2 Protoplast regeneration rates of 3 culturing methods 再生方式 再生率/% 差异显著性 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Xi±S 0.05 0.01 单层平板培养 0.40 0.35 0.50 0.60 0.65 0.53 0.51±0.11 a A 双层平板培养 0.37 0.39 0.57 0.63 0.66 0.70 0.55±0.14 a A 液体-固体平板培养 0.55 0.53 0.90 1.1 1.24 0.73 0.84±0.29 b A

表 2 原生质体不同培养方式再生率的多重比较(SSR法) Tab.2 Protoplast regeneration rates of 3 culturing methods

原生质体在含不同稳渗剂的培养基上再生率方差分析结果(表 3)表明，不同稳渗剂的培养基上原生质体再生率差异达到显著水平(P<0.05)。多重比较结果(表 4)表明原生质体在以NaCl、KCl、MgSO₄为稳渗剂的培养基上再生率比甘露醇为稳渗剂的分别提高了0.20、0.18和0.14个百分点，比蔗糖为稳渗剂的分别提高了0.23、0.21和0.17个百分点，差异达到显著水平(P<0.05)。而甘露醇与蔗糖为稳渗剂的培养基上的再生率之间差异不显著(P>0.05)。

表 3(Tab.3)

表 3 原生质体在不同稳渗剂下再生率的方差分析 Tab.3 Analysis of variance on protoplast regeneration rates with addition of osmotic pressure stabilizer 注：F0.05(4,25)= 2.76，F0.01(4,25)=4.18。 SS Df MS F Sig. 组间变异 0.278753 4 0.069688 3.519376 0.02069 组内变异 0.495033 25 0.019801 总变异 0.773787 29

表 3 原生质体在不同稳渗剂下再生率的方差分析 Tab.3 Analysis of variance on protoplast regeneration rates with addition of osmotic pressure stabilizer

表 4(Tab.4)

表 4 原生质体在不同稳渗剂下再生率的多重比较 Tab.4 Regeneration rates of protoplasts in media with different osmotic pressure stabilizers 稳渗剂 再生率/% 差异显著性 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Xi±S 0.05 0.01 NaCl 0.62 0.67 0.82 0.96 0.88 0.97 0.82±0.15 a A KCl 0.66 0.60 0.80 0.95 0.88 0.92 0.80±0.14 a A MgSO4 0.56 0.70 0.76 0.79 0.84 0.91 0.76±0.12 a A 甘露醇 0.49 0.42 0.62 0.67 0.7 0.82 0.62±0.15 b A 蔗糖 0.44 0.41 0.58 0.62 0.66 0.80 0.59±0.14 b A

表 4 原生质体在不同稳渗剂下再生率的多重比较 Tab.4 Regeneration rates of protoplasts in media with different osmotic pressure stabilizers

原生质体在不同培养基上再生率的方差分析结果(表 5)表明，不同种类的再生培养基对原生质体再生率的影响达到显著水平(P<0.05)。多重比较结果(表 6)显示，原生质体在MYG再生培养基和酵母粉蛋白胨再生培养基上的再生率平均分别比PDA再生培养基的提高了0.15和0.10个百分点，分别比子实体浸提液再生培养基的提高了0.19和0.14个百分点，差异达到显著水平(P<0.05)。原生质体在MYG再生培养基上的再生率与酵母粉蛋白胨再生培养基上的再生率之间差异不显著(P>0.05)。PDA再生培养基上的再生率与在子实体浸提液再生培养基上的再生率之间差异不显著(P>0.05)。

表 5(Tab.5)

表 5 原生质体在不同再生培养基上再生率的方差分析 Tab.5 Analysis of variance on regeneration rates of protoplast in different media 注：F0.05(3,20)= 3.10，F0.01(3,20)=4.94。 SS Df MS F Sig. 组间变异 0.14335 3 0.047783 3.334109 0.04153 组内变异 0.286633 20 0.014332 总变异 0.429983 23

表 5 原生质体在不同再生培养基上再生率的方差分析 Tab.5 Analysis of variance on regeneration rates of protoplast in different media

表 6(Tab.6)

表 6 原生质体在不同再生培养基上的再生率多重比较 Tab.6 Protoplast regeneration rates in different media 再生培养基 再生率/% 差异显著性 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Xi±S 0.05 0.01 PDA再生培养基 0.51 0.65 0.63 0.71 0.9 0.85 0.71±0.15 a A 子实体浸提液再生培养基 0.53 0.69 0.76 0.79 0.83 0.93 0.76±0.14 a A MYG再生培养基 0.76 0.81 0.80 0.86 0.94 0.99 0.86±0.09 b A 酵母粉蛋白胨再生培养基 0.75 0.89 0.86 0.90 0.95 1.05 0.90±0.10 b A

表 6 原生质体在不同再生培养基上的再生率多重比较 Tab.6 Protoplast regeneration rates in different media

不同菌龄的菌丝所制备的原生质体再生率方差分析结果(表 7)表明，不同菌龄的菌丝所制备的原生质体再生率差异达到极显著水平(P<0.01)。多重比较结果(表 8)显示，菌丝菌龄为7 d的原生质体再生率平均最高与菌丝菌龄为3 d的原生质体再生率最低之间差异达到极显著水平(P<0.01)。而菌丝菌龄为5、7、9、12 d之间的原生质体再生率差异不显著(P>0.05)，菌丝菌龄为3 d与12 d的原生质体再生率之间差异不显著(P>0.05)。

表 7(Tab.7)

表 7 不同菌龄原生质体再生率的方差分析 Tab.7 Analysis of variance for protoplast regeneration rates of mushrooms of different ages 注：F0.05(4,25)=2.76，F0.01(4,25)=4.18。 SS Df MS F Sig. 组间变异 0.50448 4 0.12612 7.758366 0.000329 组内变异 0.4064 25 0.016256 总变异 0.91088 29

表 7 不同菌龄原生质体再生率的方差分析 Tab.7 Analysis of variance for protoplast regeneration rates of mushrooms of different ages

表 8(Tab.8)

表 8 不同菌龄原生质体再生率多重比较 Tab.8 Regeneration rates of protoplast from mushrooms of different ages 菌龄/d 再生率/% 差异显著性 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Xi±S 0.05 0.01 3 0.46 0.48 0.50 0.69 0.69 0.78 0.60±0.14 a A 5 0.88 0.83 0.8 0.93 1.13 1.01 0.93±0.12 b B 7 0.88 0.71 0.96 1.04 1.06 1.11 0.96±0.15 b B 9 0.84 0.83 0.87 0.90 0.95 1.01 0.90±0.07 b B 12 0.58 0.84 0.72 0.88 0.97 0.93 0.82±0.15 ab AB

表 8 不同菌龄原生质体再生率多重比较 Tab.8 Regeneration rates of protoplast from mushrooms of different ages

酶解条件对原生质体再生率的影响如图 2所示，酶解时间、酶解温度、酶含量对原生质体再生率的影响规律一致，在一定范围内，随着酶解时间的延长、酶解温度的升高、酶含量的增加，原生质体再生率逐渐下降。原生质体再生率对酶解时间和酶解温度较为敏感。

图 2 酶解温度、酶解时间及酶含量对原生质体再生率的影响 Fig. 2 Effect of temperature,time and enzyme concentration on protoplast regeneration rate

影响原生质体再生的因素主要有原生质体自身的生理状况和培养条件两个方面。本研究从再生培养方式、稳渗剂种类、培养基种类、菌龄以及原生质体制备条件等方面对再生率的影响进行了初步研究，结果表明这些因素基本都对原生质体的再生产生显著影响。选择5~7 d的原生质体、采用液体-固体平板培养、酵母粉蛋白胨再生培养基、以NaCl、KCl为稳渗剂、低酶解温度、短酶解时间、低酶含量有利于原生质体的再生。

在实际操作的过程中，笔者采用单层平板培养法，虽然再生率低，但操作简单方便，而液体-固体平板培养，原生质体在液体培养基中得到保护和生长，涂平板后更易于萌发，因此再生率高，但在原生质体进行液体培养时，极易引起污染。稳渗剂在原生质体制备中对酶的活性有较大的影响。无机盐、糖类、醇类是常用的稳渗剂，有研究指出，磷酸盐、二价、三价离子对几丁质酶具有抑制作用，而单价阴离子(Cl^-)、单价阳离子(Na⁺、K⁺)能提高几丁质酶活性。而在本研究中发现稳渗剂种类对原生质体的再生有类似的影响，NaCl、KCl较其他稳渗剂更利于原生质体的再生。营养丰富的再生培养基有利于原生质体的再生，如酵母粉蛋白胨再生培养基和MYG再生培养基，这2种培养基中都添加VB₁，VB₁可作为细胞壁合成的营养因子或前体物质，从而提高原生质体再生率。培养基中碳源、氮源、C/N等也会影响原生质体的再生，具体情况有待于进一步研究，已有报道，金针菇原生质体在以棉籽糖为碳源的再生培养基上再生率明显高于以其他为碳源的再生培养基。正常情况下，幼龄菌丝活性高，其原生质体再生率也高。但若菌龄过小，其制备得到的原生质体非常不稳定，更容易受到损害，而且其中有很多不具备再生能力的无核原生质体，因此太小菌龄的原生质体再生率很低，5~7日龄的原生质体再生率最高，菌龄太老，原生质体活性降低，再生率有所下降。另外，老龄菌丝在原生质体的制备过程中，细胞壁较难彻底清除，残留在原生质体上的细胞壁片段使得原生质体更容易再生出完整的细胞壁。影响原生质体制备的各种因素也会影响原生质体的再生，由于原生质体的制备实质上是一系列酶解反应的结果，因此，酶的种类和含量、酶解时间、酶解温度必然也会对原生质体再生产生影响。笔者认为，酶解反应越激烈，对原生质体的损伤也就相对越大，会使得再生率下降，在一定范围内，酶含量越大、温度越高、时间越长，则酶解反应越激烈再生率越低，反之酶解反应越温和，再生率越高，本试验得出的结论与分析一致。所以，在保证原生质体产量的前提下，可以考虑适当采用温和的酶解条件制备原生质体，使其具有较高的再生率。本研究通过对杏鲍菇pl.e0091原生质体再生条件的初步研究，掌握了各因素影响原生质体再生的基本规律，为进一步开展原生质体技术育种奠定了基础。