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  福建农业学报  2015, Vol. 30 Issue (8): 727-730  
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李海琴, 傅光华, 黄瑜, 等。H5、H9亚型禽流感病毒及鸭坦布苏病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 福建农业学报, 2015, 30(8): 727-730.
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LI Hai-qin, FU Guang-hua, HUANG Yu, et al. Establishment and Application of Multiplex PCR Assay for Detection of H5、H9 Subtypes Avian Influenza Virus and Duck Tembusu Virus[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2015, 30(8): 727-730.
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基金项目

国家水禽产业技术体系建设专项(CARS-43-33);江西省对外科技合作计划项目(20144BDH80014)

通信作者

唐维国(1979-),男,副研究员,主要从事动物遗传育种、动物疫病防控研究(E-mail:77999769@qq.com)

作者简介

李海琴(1986-),女,助理研究员,主要从事禽病研究(E-mail:278030049@qq.com)

文章历史

收稿日期:2015-06-19
修改日期:2015-07-20
H5、H9亚型禽流感病毒及鸭坦布苏病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用
李海琴1, 傅光华2, 黄瑜2, 韦启鹏1, 唐维国1     
1. 江西省农业科学院畜牧兽医研究所, 江西 南昌 330200;
2. 福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 福建 福州 350013
摘要: 为建立一种能同时快速检测H5、H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)的多重PCR检测方法,根据GenBank发表的H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因和DTMUV的NS5基因序列,分别设计了3对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了同时检测H5亚型AIV、H9亚型AIV和DTMUV的多重PCR检测方法,对其特异性及敏感性进行检验,并在临床中进行初步应用。结果表明,该多重PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可同时扩增出大小分别为732 bp (H9亚型AIV)、380 bp (H5亚型AIV)、250 bp (DTMUV)的特异片段,利用本试验建立的多重PCR对其他鸭病病原体进行扩增结果均为阴性,利用这3对引物对H5、H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为533 pg·μL-1、56 pg·μL-1和6.6 ng·μL-1。对临床200份样品的检测结果表明该多重PCR检测方法具有快速、敏感、特异性强等优点,适用于临床检测应用。
关键词: H5亚型禽流感病毒    H9亚型禽流感病毒    鸭坦布苏病毒    多重PCR    
Establishment and Application of Multiplex PCR Assay for Detection of H5、H9 Subtypes Avian Influenza Virus and Duck Tembusu Virus
LI Hai-qin1, FU Guang-hua2, HUANG Yu2, WEI Qi-peng1, TANG Wei-guo1     
1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang, Jiangxi 330200, China;
2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian 350013, China
Abstract: The aim of this study is to establish a rapid multiplex PCR assay for detection of H5, H9 subtype avian influenza virus (AIV) and duck Tembusu virus (DTMUV). According to the HA gene sequences of H5 and H9 AIV and NS5 gene of DTMUV in GenBank,three primer sets specific to these three kinds of viruses were designed, respectively. The multiplex PCR for simultaneous detection of AIV (H5, H9) and DTMUV was established, and was applied to clinical testing for three kinds of viruses. The specificity and sensitivity of the multiplex PCR were tested. The results showed that the assay could specifically amplify the gene fragments of H5 AIV(380 bp),H9 AIV(732 bp),and DTMUV (250 bp), and were all negative for detection of other duck viruses.This method showed a sensitive of 533 pg·μL-1 for H5 AIV, 56 pg·μL-1 for H9, and 6.6 ng·μL-1 for DTMUV.Additionally, the detection results of 200 clinical samples indicated that this multiplex PCR method proved a a rapid, sensitive and specific tool for clinical samples detection.
Key words: H5 AIV    H9 AIV    duck Tembusu virus    multiplex PCR    

禽流感是由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的禽类全身性或呼吸性的疾病综合症[1],根据其致病性可分为高致病性和低致病性2类[2]。H5N1亚型禽流感病毒引起鸭群的暴发性死亡,而H9N2亚型禽流感病毒为低致病性禽流感病毒,并不导致感染家禽大批死亡,只引起家禽轻微的呼吸道症状,产蛋鸡产蛋量下降等[3]。但H9N2亚型禽流感病毒传播广泛,病毒有可能通过水禽的粪便排出而污染水源及其饲养场所,使水禽成为重要的传播媒介,导致病原的流行性发生[4, 5]。鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu Virus Disease,DTVD)是由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)引起的一种急性传染病[6]。该病以高热、产蛋量骤降甚至停产和卵泡出血为主要特征,病程可长达数周[7, 8, 9, 10, 11]。随着我国养鸭业的迅速发展,鸭禽流感及鸭坦布苏病已成为危害养鸭业发展的重要传染病,而且是常发病,及时准确地诊断对控制这些传染病具有非常重要的意义。目前禽流感的诊断方法主要有血凝试验、血凝抑制试验(HA、HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验、琼脂扩散试验(AGP)、病毒中和试验等,但这些方法在灵敏度、特异性、时效性、易用性、稳定性等方面存在一定的缺陷[12]。坦布苏病毒的诊断目前主要靠病毒的分离,也有一些分子生物学的方法,但还不够成熟,常会造成误诊,给养殖户造成较大损失。临床上由于坦布苏病毒感染与禽流感病毒感染常常难以区分,或者混合感染,而且禽流感病毒还有亚型的区分,因此需要对2种甚至2种以上的病毒同时进行检测,但目前的方法一次试验只能检测1种病毒,如需检测多种病毒要做多次检测,不仅费时费力,还可能造成误诊。因此,本试验旨在通过一次检测,可同时区分鸭坦布苏病毒、禽流感病毒的单一或混合感染,为及时控制疫病提供有效检测方法。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 病毒株

H5亚型AIV、H9 亚型AIV、鸭坦布苏毒株(DTMUV)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室提供;鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒、鸭副黏病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒等由华南农业大学禽病重点实验室提供。

1.1.2 主要试剂

RNA提取试剂购自TIANGEN公司;HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒购于康为试剂公司;DNA聚合酶和RNA酶抑制剂购自北京全式金生物技术有限公司;DL2000 DNA Marker购自英特生物有限公司。

1.1.3 主要仪器

美国BIO-RAD公司生产的C1000PCR仪、德国HERMLE公司生产的低温高速离心机、北京六一仪器厂生产的DYY-6C型电泳仪、美国BIO-RAD公司生产的凝胶成像系统、海尔-80℃超低温冰箱等、Quawell 公司生产的UV-Vis Spectrophotometer Q5000微量分光光度计等。

1.2 试验方法 1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank已发表的DTMUV NS5 基因、H5亚型与H9亚型 AIV HA 基因的保守核苷酸序列,用 DNA STAR和OLIGO 6.0 软件分别设计针对3种鸭病原的扩增引物,经BLAST进行特异性比对验证,分别获得3对特异性引物(表 1)。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成,置-20℃保存备用。

表 1 引物序列信息 Tab.1 Sequences of primers
1.2.2 病毒RNA提取与反转录

利用TIANamp Virus RNA Kit(离心柱型病毒RNA提取试剂盒)提取病毒RNA,用HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒进行反转录:采用20 μL体系,于EP 管中依次加入 Primer Mix 2 μL、2.5 mmol·L-1 dNTP 4 μL、RNA模板4 μL、无RNA 酶的灭菌水2 μL,总体积共12 μL,70℃孵育10 min,迅速冰浴2 min。短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底。继续向以上反应液中加入5×RT Buffer 4 μL、0.1 mmol·L-1 DDT 2 μL,RNA酶抑制剂1 μL,轻轻吹打混匀,42℃孵育2 min。加入1 μL HiFiScript(200 μ·μL-1),轻轻吹打混匀,42℃孵育50 min,85℃孵育5 min。反应结束后,短暂离心,置于冰上冷却或将制备的 cDNA置-20℃ 保存备用。

1.2.3 多重PCR反应的建立

多重PCR发应在25 μL反应体系中进行:10×buffer (2.5 μmoL·L-1) 2 μL,MgCl2(25 mmoL·L-1) 2 μL,dNTPs 2 μL,DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV上下游引物各0.5 μL,DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV基因组DNA各2 μL,Taq酶(5 U·μL-1) 0.5 μL,加dd H2O 至总体积为25 μL。对DTMUV 引物、H5亚型AIV 引物、H9亚型AIV引物用量进行优化,对终浓度组合(组合中H5亚型AIV、H9亚型AIV和DTMUV的引物对终浓度组合设置如下(0.5、0.5、0.5;0.5、1.0、0.5;0.5、1.0、1.0;1.0、0.5、0.5;1.0、1.0、1.0 μmol·L-1)反应条件进行优化,多次重复后确定引物最佳反应用量。将退火温度按50~60℃依次递增,多次重复后确定最佳退火温度,筛选出多重PCR最佳反应条件。将扩增获得的3种病原的目的片段经切胶回收纯化后,送上海生工生物技术公司进行测序,获得的测序结果经BLAST比对分析,确定所扩增序列的正确性。

1.2.4 多重PCR特异性试验

采用优化后的扩增条件,以DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV、鸭新城疫病毒、鸭肝炎病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA和番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭瘟病毒的DNA作为待测样品进行检测,并以无菌水作为阴性对照,检测三重PCR特异性。

1.2.5 多重PCR的敏感性试验

将提取的DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV 3种病毒RNA,用UV-Vis Spectrophotometer Q5000微量分光光度计测定其浓度,并按10倍递增稀释,各取1 μL,按照上述优化的PCR反应条件进行PCR检测,以其模板最高稀释倍数扩增呈阳性为其PCR的敏感度。

1.2.6 临床样品的检测

2014-2015年,于江西南昌、丰城、南丰、地区鸭群收集200份临床病料,采集肝脏、胰、脾等组织,与生理盐水按照1∶3的比例进行研磨后离心,使用TIANamp Virus RNA Kit(离心柱型病毒RNA提取试剂盒)提取病毒RNA,按优化后的多重PCR程序进行反应,计算阳性率。

2 结果与分析 2.1 多重PCR反应的建立

多重PCR反应条件为总体积20 μL:10×buffer (2.5 μmoL·L-1) 2 μL,MgCl2 (25 mmoL·L-1) 2 μL,dNTPs 2 μL,DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV上下游引物各0.5 μL,DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV基因组DNA各2 μL,Taq酶(5 U·μL-1) 0.5 μL,加灭菌水至总体积为20 μL。经GenBank数据库的BLAST比对分析表明,所获得的3个扩增片段均为相应病毒的基因序列,且与预期的扩增条带大小一致。

2.2 特异性试验

对含有DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV的核酸样品进行检测,均能扩增出与预期相符的250、380、732 bp条带,而其他鸭病病原体在相同位置并未出现特异性条带,说明该方法具有良好的特异性(图 1)。

图 1 三重PCR特异性试验 Fig. 1 Specificity test of the triplex PCR 注:M为100 bp DNA ladder; 1为鸭坦布苏病毒+H9 亚型AIV+ H5 亚型AIV; 2为H9亚型AIV; 3为H5亚型 AIV;4为鸭坦布苏病毒; 5为番鸭呼肠孤病毒; 6为番鸭细小病毒;7为鸭圆环病毒; 8为鸭新城疫病毒; 9为鸭肝炎病毒;10为鸭瘟病毒; 11为阴性对照。
2.3 敏感性试验

用UV-Vis Spectrophotometer Q5000微量分光光度计测得DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV的RNA分别为660 ng·μL-1、533 ng·μL-1、560 ng·μL-1,应用优化后的多重PCR方法对10倍梯度稀释的混合RNA进行检测,结果表明,该多重PCR对DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV的检测极限分别为6.6 ng·μL-1、533 pg·μL-1、56 pg·μL-1(图 2)。

图 2 三重PCR敏感性试验 Fig. 2 Sensitivity test of the triplex PCR 注:M为100 bp DNA ladder;1为 660 ng·μL-1DTMUV,533 ng·μL-1 H5,560 ng·μL-1 H9;2为66 ng·μL-1LDTMUV,53.3 ng·μL-1L H5,56 ng·μL-1 H9;3为6.6 ng·μL-1DTMUV,5.33 ng·μL-1 H5,5.6 ng·μL-1 H9;4为660 pg·μL-1LDTMUV,533 pg·μL-1 H5,560 pg·μL-1 H9;5为66 pg·μL-1DTMUV,53.3 pg·μL-1 H5,56 pg·μL-1 H9;6为6.6 pg·μL-1DTMUV,5.33 pg·μL-1 H5,5.6 pg·μL-1 H9。
2.4 临床样品检测

利用建立的多重PCR方法,对2014-2015年江西南昌、丰城、南丰、地区鸭群收集的200份临床病料进行检测,结果(图 3)检测出DTMUV 7份(阳性率为3.5%),H5亚型AIV 9份(阳性率为4.5%),H9亚型AIV 4份(阳性率为2%)。

图 3 三重RT-PCR临床样品部分检测结果 Fig. 3 Detection results of clinical samples using the triplex PCR 注:M为100 bp DNA ladder;1,3,6,7,8为H5亚型AIV阳性病料; 2为H9亚型AIV阳性病料; 4,5为H5亚型AIV与 H9亚型AIV阳性混合病料。
3 讨 论

DTMUV和AIV的2种亚型均是当今危害养鸭业发展的主要病原体,常呈混合感染。这3种病毒对养鸭业危害较大。禽流感病毒和坦布苏病毒均能感染蛋鸡、鸭和鹅,并导致产蛋下降,在开产(蛋)鸡、开产种(蛋)鸭、肉用鸭发生坦布苏病毒时,都应注意与禽流感病毒的鉴别诊断。因此,快速并且同时检测这3种病原具有重要的临床意义。

虽然鸭坦布苏病毒及禽流感病毒都已经有RT-PCR的检测方法,但是同时检测3种病毒的诊断方法还未报道。本研究建立的多重PCR方法能够用于DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV的单纯感染和混合感染检测。多重PCR反应条件的优化是多重PCR成功的关键,比常规PCR复杂得多[13],考虑到多重PCR反应引物之间容易产生干扰,本研究设计的引物的目的片段的大小有合适的梯度(DTMUV为250 bp,H5亚型AIV为380 bp,H9亚型AIV为732 bp),引物退火条件尽可能相近(DTMUV为53℃,H5亚型AIV为53.6℃,H9亚型AIV为54.1℃),引物用量均为0.5 μL(0.5 μmol·L-1)。多重PCR的优点主要体现在能同时检测的基因数目增多及反应的敏感性、特异性等方面[14]。通过特异性和敏感性试验,发现本试验构建的多重RT-PCR能够特异性扩增出H5亚型AIV、H9亚型AIV 和DTMUV等3种病原,对鸭的其他病原不敏感,特异性良好;能同时检出6.6 ng·μL-1的DTMUV、533 pg·μL-1的H5亚型AIV、56 pg·μL-1 的H9亚型AIV,具有较高的敏感性,能满足3种病原的临床检测要求,适用于大批量检测,为及时控制疫病提供有效方法。

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