副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus是弧菌属的一种革兰氏阴性菌，它主要感染生活在温暖、含盐高的河流或海域口的水生生物上，具有较强的致病性，是主要的食源性致病菌之一。人类如果误食被其感染的海产品，会出现腹泻、腹痛、肠痉挛、恶心、呕吐和水样便等肠胃炎反应，严重时会引起全身痉挛和肾功能衰竭等临床反应^[1]。该菌最先由日本的Fujino等从食物中毒病患中分离得到，具鞭毛，无荚膜，体内无芽孢，为多形态杆菌^[2]。随着近年来海鲜贸易的全球化，由其引起的中毒事件发生比率逐年上升^[3]。建立早期快速、经济、灵敏、高效的检测方法是预防该事件发生的关键。近年来对副溶血弧菌检测方法的研究得到了很大的发展，本文综述了在免疫学、分子生物学等方面的检测方法的研究进展及其优缺点，以期为同类研究提供参考和理论依据。

培养法是检测副溶血弧菌的传统方法。我国目前对副溶血弧菌的检测方法标准为：国家标准GB/T4789.7-2008《食品卫生微生物学检验副溶血弧菌检验》，其检测步骤是：将样品经过3%氯化钠碱性蛋白胨水增加菌种数量后；转种至TCBS琼脂培养基或科玛嘉弧菌显色培养基，37℃恒温培养18～24 h后，观察形态特征，挑选可疑菌斑作生化试验^[4]。API生化试剂检测结合国标分离方法具有灵敏度高、检测时间短等特点。凌秀梅等将国标培养鉴定法与科玛嘉弧菌显色培养结合API20E生化鉴定法作对比，检测副溶血弧菌，除检测结果一致外，后者在检测时间和操作步骤方面都要优于前者，证明了后者的优越性^[5]。选择性培养基和显色培养基都能很直观地观察得到鉴定结果，也是传统的检测方法之一。在卢勉飞等开发的显色培养基(HKMVPM)上，副溶血性弧菌菌落均呈现特异性的品红色，而非副溶血弧菌则表现为蓝绿色、无色等现象，直观地得到了检测结果^[6]。Su等开发了一种显色培养基用于选择性和特异性的检测副溶血弧菌菌株^[7]，该培养方法不需要特殊的仪器和材料，但操作复杂，需经过一定的培养时间才能得到检测结果^[8]。

自1985年Mullis等^[9]向全世界公布PCR技术到目前为止，由于其优良的性能，该技术在分子生物学和食品安全监测等研究领域已经得到了十分广泛的应用。PCR检测技术的检测方法有单一PCR法、多重PCR法和实时荧光定量PCR法等，目前这些基于PCR检测技术均被用于副溶血弧菌检测。

该方法发展较早，所以目前用于检测副溶血弧菌的PCR体系较多。PCR技术的关键是模板的来源与引物的设计。从近年来对副溶血弧菌的致病机理的研究结果来看，副溶血弧菌产生临床反应的关键是其产生的毒素，包括耐热溶血素(TDH)、相对耐热溶血素(TRH)、不耐热溶血素(TLH)^{[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]}。因此最初的单一PCR检测法检测副溶血弧菌是检测其编码TDH、TRH的tdh、trh基因^{[18, 19]}，但是这2种基因的检测效率十分低^{[20, 21]}，所以被以检测编码TLH的tlh基因法代替。李青、李志锋等^{[22, 23]}分别根据副溶血弧菌tlh基因为靶标序列，设计了2对特异扩增引物，建立了相应的PCR检测体系，在分离株与标准株的检测试验中，灵敏度都达到了300 CFU·mL^-1以下。马妍等^[24]同样以tlh基因为靶标基因，建立了检测速度更快、灵敏度更高的半定量PC-PCR检测方法，此法最低可检出90 CFU·mL^-1的副溶血弧菌。除了从副溶血弧菌产生的毒素入手对其进行检测外，对其有调控外毒素表达作用的toxR基因^[25]、负责编码DNA转旋酶的B亚单位蛋白的gyrB基因^[26]以及早前已建立的pRH基因对副溶血弧菌的检测应用也十分广泛^[27]。王华丽等^[28]通过以副溶血弧菌toxR基因为靶标基因，对海洋产品进行了检测，得到的副溶血弧菌最低检出限是42 CFU·mL^-1。Venkatewara等^[29]利用gyrB基因的PCR方法检测了117株副溶血弧菌，检出限为50 CFU·mL^-1或4 pg DNA每100 μL反应体系。Rosec等就通过单一PCR发现，单独用toxR基因引物，最低检出限为250 CFU·RT^-1，而pR72H基因引物，最低检出限可至25 CFU·RT^-1 (RT：Reaction Tube=50 μL)^[30]。Lee等^[27]用pRH基因的PCR检测法从有无扩增条带来实现副溶血弧菌与非副溶血弧菌的检测，该检测法具有很强的特异性。近年来，Chen等^[31]建立的基于O-特异血清抗原的PCR方法已被用于检测环境及临床中的副溶血弧菌样本。Zhu等^[32]建立的结合叠氮碘化丙啶的定量PCR检测法以用于检测生的海产品中活的副溶血弧菌细胞个数，检测效果可靠。伦镜盛等^[33]利用叠氮溴化乙锭(Ethidium monoazide bromide，EMA)能穿过死细菌的细胞膜与基因组DNA结合的特点，建立了EMA-PCR法，在反应中加入EMA，让EMA“屏蔽”死细菌和游离状态的DNA，使其不能作为模板进行PCR扩增，从而大大提高了检测的准确性，填补了传统的PCR技术无法区别样品中的死细菌与活细菌、使检测结果出现较高的假阳性的缺陷^[34]。传统的单一PCR检测方法，以一个靶标基因设计特异引物，在实验的灵敏度、特异性、抗其他物质干扰的能力上都有一定的局限性，所以在其基础上发展了许多PCR改进技术，如多重PCR、实时荧光定量PCR等。

多重PCR(Multiplex polymerase chain reaction，MPCR)是在同一体系中加入多对引物实现多个目的基因同时扩增的PCR技术，最早于1988年由Chamberlain提出，此法因其可实现多个靶标同时检测，且消耗时间、试剂少等特点，在科研上被十分广泛地应用^[15]。以toxR、tlh、tdh、trh、fla、groEL等多个靶标基因为模板的多重PCR方法已被用于检测来自临床和环境中的致病性副溶血弧菌样本。Izumiya等形成了一种检测包括副溶血弧菌在内的3种弧菌属菌株的多重PCR检测方法，他们在同一反应体系中用ompW基因引物检测霍乱弧菌，用toxR基因引物来检测副溶血弧菌，用whA基因引物来检测创伤弧菌，在检测的125株弧菌属及8株其他菌属的结果中，除5.3%的创伤弧菌未检出外，其余均被检出，表明此法有很好的检测效果^[35]。Wang等将生物素化的PCR产物与固定在芯片上的探针杂交(tlh、tdh、fla)，通过与亲和素连接的碱性磷酸酶作为指示来检测45份样品，结果发现8株副溶血弧菌的毒力菌株和4株非毒力菌株被成功检测出来。在检测的15株弧菌属菌株中，没有发现与探针发生非特异性结合的现象。另外18株非弧菌属菌株都显示阴性反应，检测效果良好^[36]。Hossain等^[37]在同一PCR体系中通过扩增种属特异性groEL基因和trh、tdh毒力基因来检测副溶血弧菌，结果发现三者的最低检出限均为200 pg DNA。多重PCR检测方法虽然能有效地缩短检测时间，降低检测成本，减少假阴性的干扰，但是因在反应体系中加入了多对引物，引物与引物之间、引物与模板之间的非特异性结合不可避免，所以多重PCR的关键是特异性，有长度差异的靶标基因的选择和特异引物的设计^[38]。

(1) 单一实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence qualitative，PCR)就是在反应体系中加入荧光分子，通过实时观测荧光标记信号的积累得到标准曲线，再从标准曲线上得到初始模板的浓度。Tyagi等^[39]建立了以TDH为靶标的荧光定量PCR法对副溶血弧菌进行检测，得到的标准曲线的R²值>0.99，最低检出限为0.1 pg，3次试验重复的变异系数范围在1.2%～4.2%。扈庆华等^[40]利用设计的1对TDH基因引物，和用FAM荧光剂标记5′端的改良分子信标探针，对 11种对照菌和1种副溶血弧菌进行分析，结果只有副溶血弧菌有信号，且与其他细菌无交叉反应，显示了较强的特异性，DNA灵敏度为166.6 fg·μL^-1，随后他们用改良探针检测了40株标准株，结果均有特异的荧光信号。

(2)多重实时荧光定量PCR

早在2012年以前，基于不同荧光探针标记的多重实时荧光定量PCR法已经被用于检测不同海产品的所有致病副溶血弧菌^{[41, 42, 43]}。Garrido等采用多重实时荧光定量PCR检测了水及食品样品中的致病副溶血弧菌，此法对tdh的最低检出限为0.24 CFU·g^-1，对trh1的为0.44 CFU·g^-1，对trh2的为0.52 CFU·g^{-1 [44]}。卢昕等根据trh和tdh基因序列设计引物，以SYBR GreenⅠ为荧光基因，建立了单重和双重SYBR GreenⅠ荧光PCR检测方法，并用这2种方法同时对包括副溶血弧菌在内的55株菌株进行检测，结果表明2种方法都有较高的检测性能，单重荧光PCR检测下限为5×10¹拷贝·μL^-1，双重荧光PCR检测下限为5×10²拷贝·μL^{-1 [45]}。实时荧光定量PCR特异性和灵敏度高，且可以同时完成定性和定量的检测，有很广的应用前景，但因SYBR Green染料分子只有结构特异性没有序列特异性，会造成检测结果的不准确，所以其主流发展方向为TaqMan探针和分子信标荧光探针检测方法。总的来看，基于PCR的检测方法能够达到快速、灵敏、高精确度的检测，但是不足之处就是反应难以控制假阴性和假阳性的干扰，且PCR体系需要多次的优化才能达到最好的检测效果^[46]。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 是2000年Notomi等开发的一种核酸恒温扩增方法^[47]，该方法用特定的引物在恒定温度下进行DNA扩增，具有灵敏度高、特异性强的特点，已被广泛用于食品中致病菌的检测^{[48, 49]}。彭帅等^[50]以gyrB基因为靶标设计扩增引物，采用环介导等温扩增技术进行检测，结果表明该方法最低可检10 CFU·mL^-1副溶血弧菌，灵敏度可以达到0.1 pg副溶血弧菌基因组DNA。Chen等^[51]设计了5种以toxR基因为靶标的引物，建立了LAMP核酸扩增基因技术，将此方法与单一的toxR-PCR法做对比试验，对包括副溶血弧菌在内的75株菌株进行检测，采用牡蛎作加标试验，结果在每个反应体系中LAMP法最低可检出47～470个细胞，1.1×10⁵个细胞每克牡蛎，检测灵敏性比单一的PCR法高近100倍。徐芊等^[52]以tlh基因为靶标设计了4条特异扩增引物，采用LAMP法进行检测，结果副溶血弧菌基因组DNA检测灵敏度为90 fg，纯培养物的检测灵敏度为每LAMP反应体系24 CFU·mL^-1，表明所设计的引物特异性较高。Yamazaki、Nemoto、Ge等^{[53, 54, 55]}分别基于tlh、tdh、toxR基因为靶标设计引物，建立的LAMP法已经可以灵敏、快速地检测副溶血弧菌。Wang等^[56]设计了一种新颖的原位环介导等温扩增技术，能快速检测引起食物感染的副溶血弧菌菌株，比常规的LAMP和PCR有更高的特异性而且耗时更少。近期，Zeng等^[57]建立了一种将LAMP检测和免疫磁珠分离技术结合起来的新兴检测方法，用于检测生牡蛎中的副溶血弧菌，最低检出限为0.19 CFU·g^-1，从而为LAMP对致病菌株的综合检测提供了一个平台。虽然LAMP是一种用于在特定温度下快速检测致病细菌的有效、经济的方法，但是与PCR类似，因待检样品中其他成分对试验产生影响，有针对性的分离方法和浓缩方法影响了LAMP的推广使用^[58]。

核酸探针是将PCR所需的原料做标记，与荧光PCR有些相似，常用的有：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针，此法灵敏度高、简便快速。副溶血弧菌的核酸探针检测技术常常以tdh、trh和tlh基因序列为靶标探针。Nishibuchi等^[59]将寡核苷酸探针用放射性元素标记后用来检测tdh靶标基因，检测发现与免疫学相比，该方法稳定性更高。AP和DIG探针都已被用于检测tlh和tdh基因，McCarthy等^{[60, 61]}先后对两者的副溶血弧菌检测性能进行了评价，在以tlh基因为靶标的疑似菌株检测中，二者符合率都达到了98%，在以tdh基因为靶标，对副溶血弧菌、其他弧菌及非副溶血弧菌菌株的核酸探针检测中，2种探针都展现了良好的检测性能。Nordstrom等^[62]利用DNA探针对传统的划线培养与选择性扩散培养对副溶血弧菌的检测效果进行了比较，结果表明：选择性扩散培养法更好，检测速度快，只需2～3 d，大大节省检测时间。

基因芯片又称为DNA微阵列，是较先发展的一种商品化生物芯片技术。最早于1989年由Southern^[63]提出，它将已知序列的基因探针有序、高密度地固定在同一载体上，通过将已标记的靶核苷酸序列与芯片特定位点上的探针进行杂交，检测杂交信号来分析检测对象所含的基因信息。王军等^[64]制备了一种用于临床检测的DNA芯片，结合多重PCR技术，检测了64份副溶血弧菌样本，检出效果好，副溶血弧菌的检出限达到了10 CFU·mL^-1。邱杨等^[65]基于此原理建立了快速液相芯片检测方法，经过副溶血弧菌的检测试验，证明该方法灵敏度较高，可达到50～100拷贝·mL^-1。Wang等^[36]将tlh结合其他副溶血弧菌分子靶标在基因芯片上成功实现了副溶血弧菌的分子检测，结果表明检测性能良好。此法检测速度快，准确性高，高通量，但最大的缺点是制作成本高，芯片的制成需要高精密的仪器设备且制作过程步骤繁琐复杂，另一方面有些病原菌的基因序列还未被破译。未来基因芯片可以将提高探针序列的集成度和稳定性，降低生产成本作为发展方向^[38]。

免疫学检测方法是基于抗原抗体特异结合的原理上建立的，通过已知抗体检测未知抗原，或未知抗体检测已知抗原，此法特异性强，灵敏度高，已被学者用于副溶血弧菌的检测。酶联免疫吸附法是先将抗体或抗原固定在酶标板上，封闭后孵育2～3 h，加以一抗孵育2～3 h后，再加以酶标记的二抗孵育1～2 h，最后根据酶反应产生的颜色的深浅及相应的OD值定性定量检测所加的一抗原或抗体。此法具有操作简单、所需设备要求不高、特应性强等特点。

基于TDH、TLH、TRH单克隆抗体的夹心酶免疫吸附剂已被用于鉴别从临床致病副溶血弧菌中分离的蛋白^{[66, 67, 68, 69]}。杜玉萍等用副溶血弧菌及TLH抗原蛋白分别免疫生理状况良好的新西兰兔和BALB/c鼠，通过间接ELISA法检测腹水中获得的兔抗副溶血弧菌多克隆抗体和小鼠抗TLH多克隆抗体的效价，结果小鼠产生的抗体效价比兔产生的抗体效价高约15倍。经过多次稀释度梯度试验后，以兔抗包被酶标板，以鼠抗为酶标抗体，建立了ELISA双抗体夹心法，此法在副溶血弧菌检测中得到了较满意的结果^[70]。Kawatsu^[71]建立了一种免疫色谱技术，用于检测从粪便样品中富集培养的副溶血弧菌中的TDH溶血素，检测性能较好。但是以上这些单克隆抗体因为与其他细菌有交叉反应，而不能应用于检测临床和环境中的所有副溶血弧菌菌株^[72]。窦勇等^[73]将兔抗副溶血弧菌多克隆抗体为一抗，山羊抗兔IgG-HRP作为二抗建立了间接ELISA快速检测法，试验6 h后测出10⁴ CFU·mL^-1的副溶血弧菌，表明此法有较高的实用价值。池信才等^[74]用化学试剂灭活副溶血弧菌制备免疫抗原，将所得抗原免疫BALB/c小鼠，将从腹水中得到的多克隆抗体与淋巴细胞融合，通过单克隆抗体技术，得到了1株亲和力最高的抗体，将兔抗副溶血弧菌多克隆抗体为包被抗体，建立了双抗体夹心ELISA方法，用于检测14尾患病的大黄鱼与10尾健康的大黄鱼，前者中11尾检测副溶血弧菌，后者没有检出，说明此法在副溶血弧菌检测中的高特异性。

如今，类似单链可变片段重组的重组抗体片段技术已经成为一种为到达研究、诊断、治疗目的的重要手段^[75]。2012年Wang等通过噬菌体展示技术成功筛选出了1株高亲和力的抗副溶血弧菌TLH的单链抗体，这株筛选的scFv-LA3抗体对TLH抗原有很强的特异性，且对含有TLH溶血素的弧菌细胞很强的抗性^[76]。试验结果预示着scFv-LA3能识别副溶血弧菌产生的特异TLH^[75]，能作为一种抗体试剂用于检测海产品中的副溶血弧菌菌株产生的TLH^[76]。与传统的全长IgG抗体相比，灵敏的单链抗体免疫学检测方法还是有很多不足，低稳定性、低溶解性和低亲和力严重限制了它的诊断和临床上的推广^[58]。为了改善单链抗体稳定性和溶解性的问题，研究者们建立了一种Skp共表达体系来表达有功能的scFv蛋白，该共表达的蛋白有很高的溶解性和很强的与TLH抗原结合的能力^[77]。ELISA法实用性强、检测速度快、样品处理量大，费用低，最大的优点就是基于抗原抗体反应高特异性这一特点带来的高准确度，但其也有不可避免的缺点，比如对包被抗原、包被抗体和结合物的选择性高，对一些结构类似物会发生交叉反应等。

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique，ICG)，是以胶体金为标记物，通过将特异性抗原抗体反应的第一阶段放大，对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术，使用最多的为快速斑点免疫金渗滤法(DIGFA)和胶体金免疫层析法(GICA)。孔繁德等建立了检测副溶血弧菌的免疫金层析试纸条法(IGCA)，他们将兔抗副溶血弧菌IgG-2包被硝酸纤维素膜检测线，山羊抗兔IgG包被对照线，胶体金标记兔抗副溶血弧菌IgG-1制成检测试纸条，结果阳性试纸条出现红色线，此法反应灵敏，试纸条的保质期较长，37℃能存放1个月，有较高的实用价值^[78]。杨靖亚等利用双抗体夹心法检测副溶血弧菌的tdh基因，开发了能准确检测副溶血弧菌的斑点免疫胶体金渗滤测试盒，最低检测限达250 μg·mL^-1，同样具有较长的保质期^[79]。胶体金试纸条便携，检测时间短，需几分钟或十几分钟的等待时间，与API实验(18～24 h)相比有很大优势，且能够用于现场检测，有很大的研究前景，还可以和生物素-亲和素信号放大系统结合使用，缩短检测时间，但是试纸条易受温度和杂质影响，这也是未来胶体金需突破的地方。

在可实现多样品同时检测的高效液相色谱法的基础上发展起来的变性高效液相色谱法(Denaturing high performance liquid chromato-graphy，DHPLC)也被应用于副溶血弧菌的检测。廖亮等^[80]利用DHPLC在非变性温度下能进行双链DNA分离的原理，分析特异性PCR扩增产物，得到标准副溶血弧菌的特征峰型图谱，为DHPLC检测副溶血弧菌奠定了基础。王玉平^[81]建立了一种检测包括副溶血弧菌在内的5种食源性致病菌的DHPLC，在同一PCR体系中加入针对这5种菌特异毒力基因设计的引物，进行多重PCR扩增，扩增产物经过高效变性液相色谱仪检测，结果表明：此法对目的分离株的正确检测率大于98%，灵敏度小于5 CFU·mL^-1。PCR和DHPLC的联用技术大大提高了检测灵敏度和准确度，并且操作技术简便，避免了单独PCR易被污染的缺点，同时兼顾了DPHLC可同时检测多个样品的优点。

检测副溶血弧菌还有很多方法，例如传统的最大计数法、纳米PCR技术^[82]、噬菌体法^[83]、DNA指纹图谱技术^[84]等。Hayashi等^[85]于2006年发展了一种应用软琼脂包被的过滤器结合多重PCR的检测方法，用于早期海产品中副溶血弧菌产生的TDH、TRH的检测，该方法检测样本需2 d。Raghunath等^[86]研究了一种包含胆汁盐、牛碘胆酸盐钠的浓缩肉汤(ST肉汤)用于改善从海鲜中分离和检测副溶血弧菌。一种基于固体琼脂平板的光散射传感器也被用于副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的鉴定和实时检测^[87]。Duan等^[88]将双色流式细胞仪用于同时检测样品中副溶血弧菌和沙门氏杆菌，在体系中，用荧光量子点标记适配子来识别2种细菌，当采用荧光量子点纳米颗粒时，检测的灵敏度得到了大大的提升。近年来，Xiang等^[89]发展了一种基于4种包括LAMP、电化学离子结合法(结晶紫和Mg²⁺)、实时检测法、衍生物分析技术在内的实时电阻测量法，此法以依赖卵磷脂的溶血素基因为靶标，在副溶血弧菌的检测中，最低检出限为10 CFU·mL^-1，说明了此法比传统培养法有更高的精确度、灵敏度和特异性。

综观以上副溶血弧菌的检测方法，各有各的优缺点：细菌培养法对仪器设备和实验材料的要求不高，但操作复杂、需经过一定的培养时间才能得到检测结果，特异性和敏感性都不高，不能满足食品卫生检测的快速有效等要求；基于PCR技术的实时定量PCR、LAMP、核酸探针技术、基因芯片等检测方法能够达到快速、灵敏、高精确度的检测，但反应难以控制因DNA污染出现的假阳性和样品中其他物质干扰出现的假阴性，且PCR体系需要多次的优化才能达到最好的检测效果；正在新兴发展的包括酶联免疫吸附法、胶体金技术在内的免疫学检测方法，具有快速、灵敏、特异性、高精确度和准确度的优点，但对特异性抗原抗体的筛选工作耗时大，且试剂片的保质期问题也一定程度上限制了此方法的推广。所以单纯的任何一种方法无法满足多方面的要求，随着时代的发展，各种技术、仪器不断出现，可将研究方向放在多种检测技术的融合与创新上，比如说ELISA法与色谱、气相色谱、质谱联用，用色谱法分离纯化待检样品，然后将待检样品进行ELISA定性定量分析，减少ELISA中不稳定化合物和结构类似物的影响；通过基因工程技术生产出高度免疫原性的重组抗原或将多种不同蛋白质的功能构建在一起的融合蛋白，提高ELISA检测的特异性和扩大ELISA的检测范围；将基因芯片技术与生物信息学结合使用，扩宽基因芯片技术的检测范围，提高检测准确度，弥补某些天然产物序列未知的缺点；LAMP技术和生物传感器相结合，通过生物传感器收集的信息，分析待检物质的成分情况；PCR与DHPLC联用，将PCR扩增得到的靶标基因进行DHPLC检测，分析色谱峰得到检测结果。在多项技术的基础上建立能满足多方面需求的快速、经济、高效、灵敏的检测方法，才能实现副溶血弧菌的有效检测，保障食品安全。