杆菌肽是由枯草芽孢杆菌或者地衣芽孢杆菌产生的一种多肽类抗生素，主要包括杆菌肽A、B1、B2及B3等成分，其中杆菌肽A组分的活性最高。杆菌肽不仅对革兰阳性菌有很强的抗菌作用，而且对一些革兰阴性菌、放线菌、螺旋菌也有较好的抑制效果^[1]。生产中常在发酵达到杆菌肽效价最高时，在培养液中直接加入锌盐，以生成较稳定的杆菌肽锌络合物，即杆菌肽锌，是一种性能稳定、毒副作用小、无残留、安全和高效的畜禽专用抗生素饲料添加剂^[2]。

1960年美国批准杆菌肽锌作为饲料添加剂使用以来，在美国其产量已占整个合成抗生素的40%左右，日本年产10%杆菌肽锌的预混剂超过1 100 t^[3]，我国目前已有福建、河北、天津等地的兽药厂生产杆菌肽锌及其预混剂^[4]，但生产水平和生产成本与国外先进水平还有一定差距。

本研究从污染严重的海水养殖区筛选出杆菌肽产生菌地衣芽孢杆菌ZZ061，并采用常压室温等离子体(ARTP)诱变^[5]处理ZZ061，筛选杆菌肽效价提高的突变株，并通过培养基优化，进一步提高其杆菌肽效价水平，拟为杆菌肽的规模化生产和应用于水产养殖奠定研究基础。

1525高效液相色谱仪(Waters1525，美国Waters公司)，摇床(SKY- 2102,上海百典仪器设备有限公司)，超净台(HDL 哈东联)，离心机(KUBOTA5922，日本制造)，常压室温等离子体育种机(ARTP)(无锡思清源生物科技公司)。杆菌肽标准品(中国食品药品检定研究院，含量71 U·mg^-1)，蔗糖，硫酸铵等试剂均为分析纯。

出发菌株：地衣芽孢杆菌ZZ061(本室筛选保存)。指示菌：藤黄微球菌(本室保存)。指示菌牛肉膏培养基：牛肉膏 0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、琼脂粉2%。平板及斜面培养基：胰蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%、氯化钠1%、琼脂粉2%。发酵培养基：蔗糖2%、豆饼粉1.0%、(NH₄)₂SO₄ 1.5%、KH₂PO₄ 0.15%、玉米淀粉3%、MgSO₄ 0.03%、CaCO₃ 0.25%。所有培养基均在121℃灭菌22 min。

常压室温等离子体育种机电源的功率为120 W，工作气流量为10 L·min^-1，其离子体发射源与诱变样之间的距离设置为4 mm，样品量为15 μL(菌落数10×10⁶)，氦气为工作气体，照射时间为20、40、60、80、100、120、140 s。处理过的样品进行稀释涂布平板培养基，过夜37℃培养并计算致死率，获得致死曲线。

利用抑菌圈法^[6]进行诱变菌筛选实验。取长约220 mm、宽160 mm的玻璃平板，分别注入加热融化的牛肉膏培养基20 mL，放置水平台上凝固；另取5 mL牛肉膏培养基冷却至45℃，加入3 mL浓度为1×10⁶ cfu·mL^-1的藤黄微球菌悬液，摇匀，倒入含有培养基的玻璃平板上中，作为上层含菌层。在平板中以等距离打孔，将诱变菌发酵上清液(或对照液)取10 μL加入孔中，37℃培养15 h，测量抑菌圈大小。

取优良突变株单克隆接种于菌株的斜面培养基，于37℃培养过夜后，使用6 mL无菌水重悬斜面培养基上菌体，取5%接种量接入发酵培养基中，37℃下220 r·min^-1培养42 h。

将发酵摇瓶摇匀后，吸取菌株的发酵液0.5 mL置于2 mL EP管内，加入0.5 mL的无水乙醇，反复吹吸后高速离心，取上清液进行HPLC检测。

色谱条件：色谱柱依利特 Hypersil BDS C18柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流动相照美国药典USP32-NF27配制；流速 1.0 mL·min^-1；柱温 30℃；检测波长 254 nm；进样量 20 μL。

经过ARTP诱变，最终得到优良突变株SF1406，将该菌株在斜面培养基上进行连续传代，共传6代，将各代斜面进行摇瓶发酵效价的验证。

(1)突变株SF1406的单因素试验：采用单因素的试验设计，主要考察发酵培养基中玉米淀粉、豆饼粉、蔗糖、硫酸铵的含量对菌体杆菌肽产量的影响，设置梯度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%。

(2)突变株SF1406发酵配方的正交试验：选择影响菌株效价的4个主要因素，根据L₉(3⁴)正交试验因素水平表配制9种发酵培养基，接种SF1406斜面到其发酵培养基，37℃下220 r·min^-1培养42 h，使用高效液相色谱测定其发酵液的杆菌肽含量。玉米淀粉设置的水平为2%、3%、4%，蔗糖设置的水平为1%、2%、3%，豆饼粉设置的水平为0.5%、1.0%、1.5%，硫酸铵设置的水平为1.0%、1.5%、2.0%。

由图 1可知，常压室温等离子体(ARTP)对杆菌肽产生菌的致死能力很强，在照射100 s后期致死率达到了99%^[8]，为获得高杆菌肽产生菌，本项目把ARTP的诱变致死率控制在99%，在制备突变菌库的试验中，将诱变时间设置为100 s。

图 1 杆菌肽产生菌的ARTP致死率 Fig. 1 Lethal rate of ARTP on bacitracin-producing bacterium

利用地衣芽孢杆菌分泌的杆菌肽能够抑制藤黄微球菌生长的特性，采用1.2.2的抑菌圈法进行优良突变株的初步筛选如图 2所示。通过2 000个突变株的筛选，获得5株产杆菌肽水平明显提高的优良突变，株分别为SF406、SF606、SF1406、SF1606、SF1806。

图 2 诱变株的抑菌圈 Fig. 2 Antimicrobial circle of mutagenic strains

将优良突变株及原始菌ZZ061的单克隆按1.2.3和1.2.4的方法进行摇瓶发酵并测定其杆菌肽含量。结果如表 1所示，最终得到菌株SF1406，杆菌肽的产量达560 U·mL^-1，比出发菌株ZZ061提高了130%。

表 1(Tab.1)

表 1 优良突变株的杆菌肽含量 Tab.1 Bacitracin content in mutant strains 菌株 ZZ061 SF406 SF606 SF1406 SF1606 SF1806 效价/(U·mL-1) 245 510 430 560 520 490

表 1 优良突变株的杆菌肽含量 Tab.1 Bacitracin content in mutant strains

结果显示，各代的产量均为(560±10 )U·mL^-1，表明该突变株遗传性状稳定。

结果如图 3所示，表明玉米淀粉、硫酸铵、豆饼粉、蔗糖的含量提高后，突变株SF1406的杆菌肽产量都呈现了增加后降低的趋势，如图 2的A和B。玉米淀粉和蔗糖作为发酵培养基中的碳源，使用量过多会引起菌体的过量增长，反而杆菌肽的产量下降。豆饼粉和硫酸铵作为发酵培养基中的有机氮源和无机氮源，使用量过大也会造成菌体的大量生长，杆菌肽的产量也出现下降的情况，如图 3的C和D。最终确定玉米淀粉、蔗糖、豆饼粉和硫酸铵的含量分别是1.5%、2.5%、2.0%和2.0%。

图 3 不同成分培养基的影响 Fig. 3 Effect of culture media on size of inhibition zone

结果如表 2所示，各因素对杆菌肽的影响程度依次为A>D>C>B，即玉米淀粉对杆菌肽产量影响最大，其次是硫酸铵和豆饼粉，蔗糖对菌株SF1406的影响最小。分析结果表明：A₂B₃C₂D₂是菌株SF1406的最佳培养基组合，其玉米淀粉浓度为3%，硫酸铵浓度为1.5%，豆饼粉浓度为1.0%，蔗糖浓度为3.0%，经过配方验证其发酵液杆菌肽产量达810 U·mL^-1，较未优化的培养基配方提高44.0%。

表 2(Tab.2)

表 2 突变株SF1406发酵配方的正交试验 Tab.2 Orthogonal experiment on medium formulation for SF1406 culture 实验号 A B C D 效价/(U·mL-1) 1 1 1 1 1 629 2 1 2 2 2 706 3 1 3 3 3 553 4 2 1 2 3 714 5 2 2 3 1 682 6 2 3 1 2 749 7 3 1 3 2 572 8 3 2 1 3 483 9 3 3 2 1 640 K1 1.456 1.479 1.436 1.507 K2 1.654 1.445 1.592 1.565 K3 1.307 1.498 1.396 1.352 R 0.348 0.054 0.197 0.214

表 2 突变株SF1406发酵配方的正交试验 Tab.2 Orthogonal experiment on medium formulation for SF1406 culture

本试验建立了常压室温等离子体诱变地衣芽孢杆菌和快速筛选其突变株的方法，并通过正交实验对该突变株的发酵培养基进行优化设计。通过筛选2 000个突变株获得了5株产杆菌肽水平提高的菌株，其中SF1406产杆菌肽能力最高，达560 U·mL^-1，在此基础上对该菌影响发酵水平的主要4个因素蔗糖、玉米淀粉、豆饼粉和硫酸铵进行正交试验，得到一个优良配方，其摇瓶产杆菌肽达到810 U·mL^-1，比原始出发菌株提高了230%，为该菌的进一步放大研究奠定基础。