滇水金凤<i>4CL</i>基因的克隆及表达分析

陈心仪; 吴成英; 贺海皓; 黄海泉; 瞿素萍; 黄美娟

doi:10.19303/j.issn.1008-0384.2024.01.006

滇水金凤4CL基因的克隆及表达分析

doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2024.01.006

1.
西南林业大学园林园艺学院/国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心/云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心/西南林业大学园林园艺花卉研发中心，云南　昆明 650224
2.
云南省农业科学院花卉研究所，云南　昆明 650205

基金项目: 云南省重大科技专项（202102AE090052）；国家自然科学基金项目（32060364、32060366、 31860230）；云南省园林植物遗传改良与高效繁育博士生导师团队项目基金（503210103）

详细信息

作者简介:
陈心仪（1998 —），女，硕士研究生，主要从事风景园林植物资源与应用方向研究，E-mail：rhz1230@163.com

通讯作者:
瞿素萍（1972 —），女，研究员，主要从事花卉相关研究，E-mail：1035496319@qq.com

黄美娟（1972 —），女，博士，教授，主要从事园林植物方向研究，E-mail：xmhhq2001@163.com

中图分类号: S681.1
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出版历程
- 收稿日期: 2023-07-12
- 修回日期: 2023-11-27
- 网络出版日期: 2024-01-25
- 刊出日期: 2024-01-28

Cloning and Expression of 4CLs in Impatiens uliginosa

1.
College of Landscape Architecture and Horticulture Sciences, Southwest Forestry University/Southwest Landscape Architecture Engineering Technology Research Center, State Forestry and Grassland Administration/Yunnan Engineering Research Center for Functional Flower Resources and Industrialization/Research and Development Center of Landscape Plants and Horticulture Flowers, Southwest Forestry University, Kunming, Yunnan　650224, China
2.
Flower Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming, Yunnan　650205, China

摘要

摘要: 目的 4-香豆酰-CoA连接酶（4CL）作为苯丙烷类代谢途径的关键酶之一，对花青素合成起着重要作用。探究滇水金凤4CL基因（命名为Iu4CL）对滇水金凤花色调控的分子机理，为其花色调控及花色育种提供参考依据。方法以滇水金凤为材料，采用RT-PCR技术分离克隆Iu4CL1、Iu4CL2、Iu4CL3和Iu4CL4基因，并对其生物信息学进行分析；通过qRT-PCR技术对4CL基因在4种不同花色（白色、粉色、红色和深红色）及其4个不同花发育时期（花苞期S1、始花期S2、盛花期S3和谢花期S4）中的表达情况进行分析。结果 Iu4CL1、Iu4CL2、Iu4CL3和Iu4CL4的cDNA全长分别为1620、1653、1698、1638 bp，分别编码539、550、565、545个氨基酸；其中Iu4CL1和Iu4CL2分别含有2个和4个内含子，Iu4CL3和Iu4CL4没有内含子。生物信息学分析表明，Iu4CL1、Iu4CL2和Iu4CL4为稳定蛋白，Iu4CL3为不稳定蛋白；4个基因均为无信号肽疏水性蛋白；Iu4CL2有3个跨膜结构，其余3个基因均不存在跨膜结构；Iu4CL基因4个拷贝均属于AMP结合酶超级家族和腺苷酸形成域I类超级家族。同源性分析表明，Iu4CL基因的4个拷贝均与喜马拉雅凤仙花的同源性最高；且Iu4CL1和Iu4CL2处于同一个大的分支中，而Iu4CL3和Iu4CL4处于另一个大的分支中，推测可能为旁系同源。qRT-PCR分析表明，Iu4CL基因的4个拷贝在4种不同花色和4个不同花发育时期的滇水金凤花器官中均有表达，其中Iu4CL1和Iu4CL3基因在白色花器官S3（盛花期）阶段表达量最高；Iu4CL2基因在红色花器官S3（盛花期）阶段表达量达到顶峰；Iu4CL4基因在深红色花器官S3（盛花期）阶段表达量最高。结论 Iu4CL基因可能在滇水金凤花青素生物合成中发挥重要作用。
- 滇水金凤 /
- 4CL基因 /
- 花色 /
- 基因克隆 /
- 表达分析
Abstract: Objective Genes of the enzyme in the phenylpropane metabolic pathway associated with anthocyanin synthesis of Impatiens uliginosa were studied for breeding purposes. Method RT-PCR was employed to isolate and clone Iu4CL1,Iu4CL2, Iu4CL3, and Iu4CL4 for bioinformatic analysis. Expressions of the genes in the flowers of different colors (i.e., white, pink, red, and deep red) at the budding (S1), initial flowering (S2), blooming (S3), and withering (S4) stages of I. uliginosa were determined using qRT-PCR. Result Iu4CL1, Iu4CL2, Iu4CL3, and Iu4CL4 had the cDNA lengths of 1620 bp, 1653 bp, 1698 bp, and 1638 bp encoding 539, 550, 565, and 545 amino acids, respectively. Iu4CL1 contained 2 introns and Iu4CL2, 4, but Iu4CL3 and Iu4CL4 had none. All 4 genes were signal peptide-free hydrophobic proteins, but only Iu4CL3 was unsterilized. Iu4CL2 had 3 transmembrane structures, but the other 3 had none. All of them belonged to the AMP-binding enzyme superfamily and the adenylate-forming domain class I superfamily with the highest homology with I. uliginosa. Iu4CL1 and Iu4CL2 were in one large branch, while Iu4CL3 and Iu4CL4 in another, suggesting a paraphyletic homology. The expressions of Iu4CL1 and Iu4CL3 peaked in S3 on the white flowers, Iu4CL2 on red flowers, and Iu4CL4 on dark red I. uliginosa. Conclusion It was evident that Iu4CLs played a crucial role in the anthocyanin biosynthesis of I. uliginosa.
- Impatiens uliginosa /
- 4CLs /
- flower color /
- gene cloning /
- expression analysis

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图 1 4种不同花色滇水金凤及4个不同花发育时期

Figure 1. Four colors and 4 development stages of I. uliginosa flowers

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图 2 滇水金凤Iu4CL基因克隆

Figure 2. Cloning of Iu4CL genes from I. uliginosa

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图 3 滇水金凤Iu4CL基因序列分析

Figure 3. Sequences of Iu4CLs from I. uliginosa

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图 4 滇水金凤Iu4CL基因蛋白三级结构的预测

Figure 4. Predicted tertiary structures of Iu4CLs fromI. uliginosa

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图 5 滇水金凤Iu4CL的同源氨基酸序列比对

Figure 5. Homologous amino acid sequence alignment of Iu4CLs from I. uliginosa

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图 6 基于滇水金凤Iu4CL氨基酸序列构建的系统进化树

Figure 6. Phylogenetic tree based on amino acid sequence of Iu4CLs from I. uliginosa

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图 7 滇水金凤Iu4CL基因相对表达量

A：Iu4CL基因在4中不同花色盛花期的相对表达分析；B：Iu4CL基因在红色花器官的4个不同花发育时期的相对表达分析；不同字母差异显著（P<0.05）。

Figure 7. Relative expressions of Iu4CLs from I. uliginosa

A: Relative expressions of Iu4CLs in S3 for I. uliginosa of different flower colors; B: Relative expressions of Iu4CLs at 4 flower development stages of red I. uliginosa; a and b: data with different letters indicate significant difference at (P <0.05).

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表 1 4种不同花色滇水金凤采集地信息

Table 1. Information on collection locations of I. uliginosa of different flower colors

颜色 Color	采集地 Locality	经纬度 Latitude and longitude	海拔 Altitude/m
白色 White	昆明市阿子营 Aziying, Kunming	102°45′36″ E， 25°19′12″ N	2113
粉色 Pink	昆明市阿子营 Aziying, Kunming	102°45′36″ E， 25°19′12″ N	2113
红色 Red	昆明市捞鱼河湿地公园 Laoyuhe Wetland Park, Kunming	102°46′12″ E， 24°49′99″ N	1910
深红色 Deep Red	昆明市石林大叠水风景区 Dadieshui Scenic Spot, Kunming	103°12′ E，24°39′36″ N	1890

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表 2 Iu4CL基因引物序列

Table 2. Primer sequences of Iu4CLs

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence（5′-3′）	用途 Purpose
4CL1-F	ATGGAGAAATCTGGCTATGGAAG	全长克隆 Full Length Clones
4CL1-R	AGTGGGCTTTACAGCTTGGAC
4CL2-F	CTTGTCAGCTATGGCGCATAAC
4CL2-R	CCTAAAGCTTCGAGATAGCAAGC
4CL3-F	ATGTTGTCGATTCAAACAAACCAG
4CL3-R	TTAGGAAGCAAGTAATTTGGCTCG
4CL4-F	ATGGAGGCGGCTAATGCTAAG
4CL4-R	GTTAAAAATGACCAGCAACTAATC
4CL1-F	CGTGTTATGCAGGGGTACGG	qRT-PCR
4CL1-R	TGGAGACAGAGCCTTGGAAC
4CL2-F	TGTTGGGTCCGATTCCGATG
4CL2-R	AACGGAGAGACAGACGATGG
4CL3-F	ATGCTGAGGGATGGCTACAC
4CL3-R	GTGGCACCTGAAACCCTTTG
4CL4-F	ATCCAGTCGTTCCCGACGAATAC
4CL4-R	CGGCATCTCAATTTCATCCACC
Actin-F	TGAATGTCCCTGCTGTTTG
Actin-R	ACCTTCCGCATAACTTTACC

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表 3 滇水金凤Iu4CL蛋白生物信息学分析

Table 3. Bioinformatics of Iu4CLs from I. uliginosa

蛋白名称 Protein name	蛋白分子量 Protein molecular weight/kDa	总原子数 Total atomic number	分子式 Molecular formula	理论等电点 Theoretical isoelectric point	疏水系数 Hydrophobic coefficient	不稳定指数 Instability index	信号肽 Signal peptides	跨膜结构域 Transmembrane domains
4CL1	59.32	8428	C₂₆₇₅H₄₂₅₄N₇₀₀O₇₈₀S₁₉	8.15	95.06	35.01	否	否
4CL2	60.13	8540	C₂₇₀₃H₄₃₀₈N₇₁₂O₈₀₀S₁₇	8.40	94.31	36.40	否	是
4CL3	61.60	8775	C₂₇₈₇H₄₄₃₉N₇₁₁O₈₂₁S₁₇	5.67	102.81	43.51	否	否
4CL4	59.84	8466	C₂₆₇₈H₄₂₆₈N₆₉₈O₇₉₅S₂₇	5.45	97.14	38.56	否	否

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