CRISPR/Cas9 Technology-generated High-amylose Rice Varieties
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摘要:目的 通过CRISPR/Cas9基因编辑技术遗传改良水稻种质，创制高直链淀粉新材料。方法 以水稻品种中花11为试验材料，利用CRISPR/Cas9编辑系统对水稻淀粉分支酶（Starch branching enzymes, SBE）基因OsSBE 3进行靶向编辑，利用PCR技术鉴定无标记纯合突变体，并测定其淀粉含量。结果 T0代获得10株突变体株系，T1代获得5个无标记纯合突变株系，其中4个株系（sbe3-22-6、sbe3-25-3、sbe3-25-4、sbe3-25-6）的直链淀粉含量和淀粉直支比显著高于野生型。结论 本研究创制了高直链淀粉含量的水稻新种质，为水稻品质改良提供了参考。Abstract:Objective A series of new rice germplasms with high content of amylose derived from Zhonghua 11 using the CRISPR/Cas9 technology was generated.Method The gene of starch branching enzyme in rice, OsSBE3, was targeted for the genetic editing by CRISPR/Cas9. Homozygous T-DNA-free mutants were verified by PCR with starch content measured.Result Ten mutant lines were obtained from the T0 generation. From the T1 generation, 5 homozygous T-DNA-free lines were obtained that included 4 lines, i.e., sbe3-22-6, sbe3-25-3, Sbe3-25-4, and sbe3-25-6, showing significantly increased amylose content and amylose/amylopectin ratio over the wild type.Conclusion A series of new rice germplasms with high amylose content was created.
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Keywords:
- Rice /
- amylose /
- amylopectin /
- amylose/amylopectin ratio /
- genetic editing /
- CRISPR/Cas9
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0. 引言
【研究意义】目前，世界上有一半以上的人以水稻（Oryza sativa L.）为主食[1]，预计到2050年世界人口会增长至90亿，迫切需要增加水稻产量以保证粮食需求[2]。与饮食相关的慢性疾病，如肥胖、高血压和糖尿病等，在发达国家和发展中国家都普遍存在[3]。据报道，水稻消费量的增加与糖尿病发病风险的增加具有相关性[4]。直链淀粉含量较高的谷物是抗性淀粉良好来源[5]，可以降低以上疾病的发病风险，有益于人类健康[6−7]。近年来，谷物高直链淀粉等品质性状的研究受到了广泛关注。【前人研究进展】直链淀粉和支链淀粉是淀粉的两种主要成分。直链淀粉是一种线性聚合物，主要由1、4连接的α-D-葡聚糖链组成，而支链淀粉是具有α -1,6糖苷键的高度支链葡聚糖[8]。根据稻米中直链淀粉与支链淀粉比例（简称为淀粉直支比）的变化，将不同的水稻品种分为蜡质（0～0.05）、极低直链淀粉含量（Amylose content, AC）（0.05～0.12）、低AC（0.12～0.20）、中等AC（0.20～0.25）和高AC（0.25～0.33）[9]。抗性淀粉与直链淀粉含量呈正相关，高直链淀粉含量的水稻籽粒一般也含有较高的抗性淀粉，抗性淀粉在胃与小肠中不易被消化吸收，会直接进入大肠[10]，可通过促进大肠中的有益微生物群发酵来降低结直肠癌的发病率，并通过饮食降低蛋白质诱导的结肠细胞DNA损伤[11]。在植物中，淀粉生物合成是一个及其复杂的过程，需要各种酶的协同作用，包括颗粒结合淀粉合酶（Granulebound starch synthase, GBSS）、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-gluccose pyrophosphorylase, AGPase）、淀粉合酶（Soluble starch synthase, SS）、淀粉分支酶（Starch branching enzymes, SBE）和淀粉脱支酶（Starch debranching enzyme, DBE）。ADP-葡萄糖是淀粉生物合成的前体，由葡萄糖-1-磷酸通过AGPase的作用产生[12]。随后，直链淀粉由GBSS主要参与合成，支链淀粉由SS、SBE和DBE协同作用合成，SS和SBE分别负责葡聚糖链的延长和分支点的形成，SS和SBE产生的不规则葡聚糖结构由DBE进行修剪，以获得有序的支链淀粉支链[13]。在淀粉生物合成过程中SBE可催化支链淀粉α -1,6-糖苷键，参与支链淀粉簇内短链的形成，因此SBE在形成支链淀粉独特精细结构中有着重要作用[14]。提高直链淀粉含量和淀粉直支比，可以通过两种途径实现，一是过表达GBSS（也称Waxy）等位基因促进直链淀粉合成[15]，二是抑制支链淀粉合成基因的表达，如SS、SBE和DBE等，降低支链淀粉含量，促进直链淀粉的合成[16]。在小麦（Triticum aestivum L.）、大麦（Hordeum vulgare L.）和水稻等作物中[17−20]，SBE基因突变可使分支频率降低，导致超长分支链的产生，从而导致突变体直链淀粉增加。直链淀粉合成增加、支链淀粉合成降低，以及支链淀粉中间组分的超长链是高直链淀粉株系直链淀粉增加的原因，且随着直链淀粉增加，在支链淀粉中检测到的长支链降低[17]。在大麦中，通过RNA干扰技术同时抑制所有SBE基因，会导致产生纯直链淀粉大麦[18]。在小麦中，所有SBE基因组合突变品系的抗性淀粉增加[19]。在水稻中，SBE3编码的淀粉分支酶能将α -1,6键引入淀粉中，对于支链淀粉形成起着至关重要的作用，通过化学处理、辐射等方式，可以产生高直链淀粉SBE3突变体[20−21]。基因组编辑技术可实现体内DNA序列的精确修饰，为作物改良提供了可能[22]。CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术可以改良作物主要农艺性状、种质创新以及缩短植物育种周期。该技术已被优化并用于各种作物，包括小麦、玉米（Zea mays L.）、花生（Arachis hypogaea L.）、大豆（Glycine max L. Merr.）等[23]。CRISPR/Cas9技术在水稻中的应用十分成熟，利用CRISPR/Cas9技术创制高直链淀粉水稻种质已成为水稻品质改良的关键技术之一[24]。【本研究切入点】水稻胚乳中主要有4个SBE基因，它们分别是SBEI、SBEIIa、SBEIIb（OsSBE3）和SBEIII。根据水稻数据库我们发现，OsSBE3在水稻籽粒中的表达量最高，在水稻发育过程中主要负责胚乳淀粉积累。而目前利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑OsSBE3创制高直链淀粉水稻种质的相关研究较少。【拟解决的关键问题】本研究拟用CRISPR/Cas9基因编辑系统对OsSBE3进行靶向编辑，探究其突变体籽粒淀粉含量的变化，以获得高直链淀粉的水稻种质。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
以水稻种质中花11号为试验材料，种植于贵州师范大学荞麦产业技术研究中心植物生长室。
主要试剂包括T4 DNA连接酶、Eco31 I限制性内切酶、Lgu I限制性内切酶、Bsa I限制性内切酶、DNA聚合酶（Taq）、T4 Buffer和PCR Mix（武汉伯远生物科技有限公司）等，DNA Loading Buffer和DNA Marke购自天根生化（北京）科技有限公司。引物合成及基因测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.2 试验方法
1.2.1 OsSBE3基因编辑靶位点的选择及引物设计
从水稻基因组注释网站（http://rice.uga.edu/）获取OsSBE3（LOC_Os02g32660）序列，在NCBI网站（hppt://www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行BLAST比对，利用CRISPR-GE（http://skl.scau.edu.cn/）软件设计2个特异性靶位点序列进行后续试验，分别为靶序列1：GAGAGCAGCGACCGCGACGTCGG；靶序列2：TTGCTCATGCGGTCTGCATTTGG。
以Primer 5.0软件设计引物，所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体引物序列见表1。
表 1 引物信息Table 1. Information on primers applied引物名称
Primer name引物序列（5′-3′）
Primer sequence (5′- 3′)用途
ApplicationYL-Hu-SBE3-Y1+ cagtGGTCTCatgcaGAGAGCAGCGACCGCGACGT 载体构建 Carrier construction YL-Hu-SBE3-Y1- cagtGGTCTCaaaacACGTCGCGGTCGCTGCTCTC 载体构建 Carrier construction YL-Hu-SBE3-B1+ cagtGGTCTCatgcaTTGCTCATGCGGTCTGCATTt 载体构建 Carrier construction YL-Hu-SBE3-B1- cagtGGTCTCaaaacAATGCAGACCGCATGAGCAA 载体构建 Carrier construction Pyl- ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGT 鉴定引物 Identification primer Pbw2- GCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG 鉴定引物 Identification primer Cas9-CL-F GAACGGTCGTAAGAGGATGC 无标记检测 Unmarked detection Cas9-CL-R GGTGATGGACTGGTGGATGAG 无标记检测 Unmarked detection SBE3-C-F TGAAGGTGTCACTTATCGAGAA 纯合突变检测 Homozygous mutation detection SBE3-C-R ACCACTGCGCTATACATGCGTT 纯合突变检测 Homozygous mutation detection HYG-F GGTGATGGACTGGTGGATGAG 鉴定引物 Identification primer HYG-R GGAAGTGCTTGACATTGGGGAGTTT 鉴定引物 Identification primer 32660-BA1-F GCGCACACCCACACACCGACCA 靶点1检测 Target 1 detection 32660-BA1-441Rg GCGAACGGCACCTGGACACGAGA 靶点1检测 Target 1 detection OsBE3_BA2_R ACCACTGCGCTATACATGCGTT 靶点2检测 Target 2 detection OsBE3_BA2_F TGAAGGTGTCACTTATCGAGAA 靶点2检测 Target 2 detection 黑色下划线表示Eco31 I/Bsa I酶切位点，小写斜体字母为酶切位点的保护碱基。
Black underline: Eco31 I/Bsa I cleaving site; lowercase italics: protective base of site.1.2.2 YL-Hu-SBE3载体构建
首先构建两个中间载体（YL-Hu-SBE3载体构建-Y1、YL-Hu-SBE3载体构建-B1），引物名称分别是YL-Hu-SBE3-Y1+/−和YL-Hu-SBE3-B1+/−（引物序列见表1），以YL-Hu质粒（含gRNA）为模板，两个特异性引物Y1+/−和B1+/−进行PCR扩增以得到SBE3基因gRNA片段，PCR产物标记为YL-Hu-SBE3载体构建-Y1和YL-Hu-SBE3载体构建-B1。
对YL-Hu质粒用Bsa I和Eco31 I进行双酶切后连接。T4 Buffer 1 µL，Bsa I和Eco31 I各 0.5 µL，质粒YL-Hu-SBE3载体构建-Y1 2 µL，质粒YL-Hu 1.5 µL，T4-DNA连接酶0.5 µL，ddH2O补足至10 µL，37 ℃反应2 h。YL-Hu-SBE3载体构建-B1反应体系同上。各取5 µL酶切连接产物进行转化，获得重组质粒，1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒质量。
构建好的两个中间载体用Lgu I进行酶切连接。T4 Buffer 1 µL，Lgu I 0.5 µL，质粒YL-Hu-SBE3载体构建-Y1 1.5 µL，质粒YL-Hu-SBE3载体构建-B1 1.5 µL，T4-DNA连接酶0.5 µL，ddH2O补足至10 µL，37 ℃反应2 h。取5 µL酶切连接产物进行转化，挑取10个菌斑以Pyl-与Pbw2-为引物（引物序列见表1）进行菌液PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序。
1.2.3 农杆菌介导的遗传转化
由武汉伯远生物科技有限公司通过农杆菌介导法[25]对中花11号水稻进行遗传转化。
1.2.4 靶点突变检测
取T0代和T1代单株幼叶，以CTAB法[26]提取DNA，用靶点1和靶点2特异性引物扩增sgRNA靶向位点，1%凝胶电泳检测扩增产物，胶回收条带特异并且大小正确的片段，进行测序。
1.2.5 无转基因原件纯合突变体的检测
为了获得中花11号水稻无标记纯合突变体，将编辑SBE3基因的T0代水稻种植于贵州师范大学荞麦产业技术研究中心植物生长室进行自交，选取T1代水稻幼叶片，采用CTAB法提取DNA。对于无转基因原件（无CRISPR/Cas9载体T-DNA插入原件）株系检测，用特异性引物Cas9-CL-F和Cas9-CL-R（引物序列见表1）进行PCR扩增，产物用1%凝胶电泳进行检测，没有条带则说明该植株没有转基因原件。对于纯合突变体检测，用特异性引物SBE3-C-F和SBE3-C-R（引物序列见表1）进行PCR扩增，产物用1%凝胶电泳进行检测后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.2.6 水稻淀粉的测定
（1） 淀粉标准曲线的制作
采用双标双波长比色法制作淀粉标准曲线。称取0.1 g的直/支链淀粉标准品于50 mL离心管内，加入适量的无水乙醇润湿样品，再加入10 mL 2 mol·L−1的KOH溶液，100 ℃水浴15 min，冷却至室温后定容至50 mL，即为2 mg·mL−1的直/支链淀粉标准溶液。
（2）标准曲线溶液配制
混合标准曲线配制：取直链和支链淀粉标准溶液配制混合标准曲线溶液，于50 mL容量瓶内，加入25 mL蒸馏水，用2 mol·L−1 HCl调pH至3.0左右，加入0.5 mL碘试剂，用蒸馏水定容至50 mL，静置25 min。测定597 、480 、541 、700 nm下的吸光值。直链淀粉的标准曲线以ΔA 直= A597−A480为纵坐标，支链淀粉的标准曲线以ΔA支=A541−A700为纵坐标。
（3） 水稻淀粉测定
选取20颗颗粒饱满的水稻种子置于30 ℃烘箱中烘干，将烘干后的水稻种子剥壳并研磨过100目筛。称取0.1 g样品于50 mL离心管中（3个生物重复），加入10 mL无水乙醇，80 ℃水浴30 min，取出冷却至室温，7000 r·min−1离心5 min，弃上清留沉淀，加入10 mL 2 mol·L−1 KOH溶液，100 ℃水浴15 min，取出冷却至室温。取1 mL于50 mL离心管中，加入9 mL蒸馏水稀释，取200 µL样液（3个技术重复）于2 mL离心管内，加入1 mL蒸馏水，用10 µL 2 mol·L−1 HCl调pH至3.0左右，对照组加入4 µL 2 mol·L−1 HCl，加入20 µL碘试剂，补水至刻度线，静置25 min，测定597 、480 、541 、700 nm下的吸光值。
2. 结果与分析
2.1 YL-Hu-SBE3载体构建
对中间载体YL-Hu-SBE3载体构建-Y1和YL-Hu-SBE3载体构建-B1的质粒进行酶切、连接、转化，挑取10个单菌落用特异性引物Pyl-与Pbw2-（引物序列见表1）进行菌液PCR鉴定，最终构建表达载体YL-Hu-SBE3（图1）。
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图 1 YL-Hu-SBE3基因编辑载体信息红色方框表示gRNA插入位置。Figure 1. Information on YL-Hu-SBE3 knockout vectorRed box: gRNA insertion position.2.2 T0代植株突变频率与类型
通过农杆菌介导法将OsSBE3基因编辑载体转入野生型水稻后，共获得14株T0代独立株系。测序结果表明，共有10个株系发生突变，突变率为71%。10个突变株系均由靶标2突变所致。其中4株双等位纯合突变（sbe3-6、sbe3-22、sbe3-25、sbe3-26），6株双等位杂合突变（sbe3-1、sbe3-10、sbe3-12、sbe3-29、sbe3-33、sbe3-35）。突变类型包括碱基的插入（sbe3-6、sbe3-29）和缺失（sbe3-1、sbe3-10、sbe3-12、sbe3-22、sbe3-25、sbe3-26、sbe3-33、sbe3-35）两种类型（图2）。
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图 2 基因编辑T0代水稻突变体的检测WT表示野生型；黑色下划线表示靶点2序列；红色字体表示碱基插入；黑色虚线表示碱基缺失；||表示染色体正负链。Figure 2. Detection of mutant lines in T0 generation riceWT: Wild type; black underline: sequence of Target 2; red font: base insertion; black dotted line: base deletion; ||: plus and minus chains of chromosome.2.3 T1代无转基因原件突变体的获得
为获得无转基因原件（无CRISPR/Cas9载体T-DNA插入原件）的水稻植株，选取T1代水稻叶片提取DNA，用特异性引物Cas9-CL-F和Cas9-CL-R进行PCR扩增，1%凝胶电泳检测PCR产物，在500 bp左右没有条带说明不含转基因原件。获得不含转基因原件的水稻突变体共13株，分别为sbe3-6-1、sbe3-26-4、sbe3-12-4、sbe3-22-6、sbe3-26-7、sbe3-25-2、sbe3-33-1、sbe3-25-3、sbe3-25-7、sbe3-31-2、sbe-25-5、sbe3-25-4和sbe3-25-6（图3）。
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图 3 T1代突变体无T-DNA插入原件筛选M：DL2000 DNA 标记；WT：野生型。泳道1～55 为sbe3 T1代突变体植株，其中5、6、10、11、18、23、24、26、27、31、37、39和54分别是sbe3-6-1、sbe3-26-4、sbe3-12-4、sbe3-22-6、sbe3-26-7、sbe3-25-2、sbe3-33-1、sbe3-25-3、sbe3-25-7、sbe3-31-2、sbe-25-5、sbe3-25-4和sbe3-25-6。Figure 3. Selection of T-DNA-free mutants in T1 generationM: DL2000 DNA marker; WT: wild type. Lanes 1–55: sbe3 mutants in T1 generation, of which 5, 6, 10, 11, 18, 23, 24, 26, 27, 31, 37, 39, and 54 represent sbe3-6-1, sbe3-26-4, sbe3-12-4, sbe3-22-6, sbe3-26-7, sbe3-25-2, sbe3-33-1, sbe3-25-3, sbe3-25-7, sbe3-31-2, sbe-25-5, sbe3-25-4, and sbe3-25-6, respectively.2.4 T1代纯合突变体的鉴定
提取上述获得无转基因原件突变体幼叶DNA，用特异性引物（SBE3-C-F和SBE3-C-R）进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，分析突变体是否纯合。测序峰图如图4所示，表明其中5个突变体为纯合突变体，即sbe3-12-4（图4 -B）、sbe3-22-6（图4 -C）、sbe3-25-3（图4 -D）、sbe3-25-4（图4 -E）、sbe3-25-6（图4 -F）。
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图 4 OsSBE 3基因 T1代突变体测序峰图A：OsSBE3基因结构和靶点2示意图； B～F：sbe3-12-4、sbe3-22-6、sbe3-25-3、sbe3-25-4和sbe3-25-6测序峰图；黑色下划线：靶点2位置；箭头：突变位置。Figure 4. Sequences and peak map of Ossbe3 mutants in T1 generationA: Schematic diagram of gene structure and Target 2 of OsSBE3; B–F: sequences and peak map of sbe3-12-4, sbe3-22-6, sbe3-25-3, sbe3-25-4, and sbe3-25-6, respectively; black underline: position of target 2; arrow: mutation position.2.5 淀粉含量测定与分析
2.5.1 直链淀粉与支链淀粉标准曲线
直链淀粉标准曲线如图5所示，得y =0.0074x+0.0125，指数曲线相关性显著，R2 =0.9966，其在直链淀粉浓度范围内呈现良好的线性关系。支链淀粉标准曲线如图6所示，得y =0.0043x−0.1143，指数曲线相关性显著，R2 =0.9995，其在支链淀粉浓度范围内呈现良好的线性关系。
2.5.2 水稻淀粉含量分析
分析5株纯合突变且无转基因原件的SBE3基因突变体水稻籽粒的直链淀粉含量（图7 -A）、支链淀粉含量（图7 -B）和淀粉直支比（图7 -C），其中4株突变体（sbe3-22-6、sbe3-25-3、sbe3-25-4、sbe3-25-6）的直链淀粉含量和淀粉直支比显著高于野生型，支链淀粉含量没有显著差异。
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图 7 OsSBE3基因编辑后代淀粉含量A：直链淀粉含量；B：支链淀粉含量；C：淀粉直支比；****：与WT相比，差异极显著（P＜0.01）；ns：与WT相比，没有显著差异（P＞0.05）。Figure 7. Starch content of progeny after genetic editing on OsSBE3A: Amylose content; B: amylopectin content; C: amylose/amylopectin ratio; ****: extremely significant difference from WT (P＜0.01); ns: not significantly differ from WT (P＞0.05).3. 讨论
在水稻中，通过CRISPR/Cas9进行基因组编辑已广泛应用，例如编辑Waxy基因控制水稻胚乳直链淀粉合成，编辑OsRR22基因提高水稻耐盐性等[27−28]。高直淀粉含量已成为改良水稻品质的关键目标。本研究表明CRISPR/Cas9技术可以应用于水稻高直链淀粉的种质创制。本研究设计了2个特异性靶点进行基因编辑试验，成功构建了OsSBE3基因的基因编辑载体YL-Hu-SBE3，利用农杆菌介导法将OsSBE3基因编辑载体转入野生型水稻，获得具有育种价值的纯合突变植株。T0代共获得14株独立株系，其中10株为阳性株系，经检测这10株阳性植株均为靶标2突变，其中有4株（sbe3-6、sbe3-22、sbe3-25、sbe3-26）双等位纯合突变，突变类型以碱基缺失为主；靶标1没有发生突变，可能是因为该靶点的特异性不高。对靶标2突变株系T0代自交繁殖获得的T1代水稻突变体进行无转基因原件纯合突变筛选，选出5株既无转基因原件又纯合突变的植株。与杂交育种、诱变育种等育种方式相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术可快速完成目的基因的敲除、替换、插入与缺失等修饰操作。
高直链淀粉因其不同于普通淀粉的理化性质和对人类存在潜在益处，在保健食品、材料和制药等领域应用前景十分广阔[29]。直链淀粉含量与抗性淀粉含量呈正相关，直链淀粉含量高的水稻籽粒倾向于具有较高水平的抗性淀粉[9]。在正常谷物胚乳中SBEs的抑制可降低支链淀粉的支链长度与分支度，并随着淀粉中直链淀粉含量的增加，最终导致抗性淀粉水平升高[17]。本研究利用CRISPR/Cas9技术对水稻淀粉分支酶基因OsSBE3进行靶向编辑，获得了水稻OsSBE3基因的突变体，对T1代水稻突变体进行无转基因原件纯合突变筛选，选出5株既无转基因原件又纯合突变的植株。突变体和野生型水稻籽粒的淀粉含量测定结果表明，80%的突变体的籽粒直链淀粉含量和淀粉直支比显著高于野生型。周小耕[30]和 Biswas[31]通过CRISPR/Cas9靶向突变水稻SBEs和SSⅢ基因，发现T1代突变体的直链淀粉含量比野生型高；同时，Biswas还发现SBE3基因纯合突变体的直链淀粉与抗性淀粉含量均比其他SBE基因突变体高，本研究结果与他们的结果相似，表明在水稻淀粉合成过程中SBE3的缺失会导致直链淀粉含量和淀粉直支比升高。
本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑系统对水稻SBE3进行突变，在T1代获得SBE3基因序列变异且无转基因原件的纯合突变体，改变了水稻直链淀粉含量和直支链淀粉比例，获得了高直链淀粉水稻新种质，为定向改良水稻品质提供了理论依据。
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图 1 YL-Hu-SBE3基因编辑载体信息
红色方框表示gRNA插入位置。
Figure 1. Information on YL-Hu-SBE3 knockout vector
Red box: gRNA insertion position.
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图 2 基因编辑T0代水稻突变体的检测
WT表示野生型；黑色下划线表示靶点2序列；红色字体表示碱基插入；黑色虚线表示碱基缺失；||表示染色体正负链。
Figure 2. Detection of mutant lines in T0 generation rice
WT: Wild type; black underline: sequence of Target 2; red font: base insertion; black dotted line: base deletion; ||: plus and minus chains of chromosome.
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图 3 T1代突变体无T-DNA插入原件筛选
M：DL2000 DNA 标记；WT：野生型。泳道1～55 为sbe3 T1代突变体植株，其中5、6、10、11、18、23、24、26、27、31、37、39和54分别是sbe3-6-1、sbe3-26-4、sbe3-12-4、sbe3-22-6、sbe3-26-7、sbe3-25-2、sbe3-33-1、sbe3-25-3、sbe3-25-7、sbe3-31-2、sbe-25-5、sbe3-25-4和sbe3-25-6。
Figure 3. Selection of T-DNA-free mutants in T1 generation
M: DL2000 DNA marker; WT: wild type. Lanes 1–55: sbe3 mutants in T1 generation, of which 5, 6, 10, 11, 18, 23, 24, 26, 27, 31, 37, 39, and 54 represent sbe3-6-1, sbe3-26-4, sbe3-12-4, sbe3-22-6, sbe3-26-7, sbe3-25-2, sbe3-33-1, sbe3-25-3, sbe3-25-7, sbe3-31-2, sbe-25-5, sbe3-25-4, and sbe3-25-6, respectively.
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图 4 OsSBE 3基因 T1代突变体测序峰图
A：OsSBE3基因结构和靶点2示意图； B～F：sbe3-12-4、sbe3-22-6、sbe3-25-3、sbe3-25-4和sbe3-25-6测序峰图；黑色下划线：靶点2位置；箭头：突变位置。
Figure 4. Sequences and peak map of Ossbe3 mutants in T1 generation
A: Schematic diagram of gene structure and Target 2 of OsSBE3; B–F: sequences and peak map of sbe3-12-4, sbe3-22-6, sbe3-25-3, sbe3-25-4, and sbe3-25-6, respectively; black underline: position of target 2; arrow: mutation position.
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图 7 OsSBE3基因编辑后代淀粉含量
A：直链淀粉含量；B：支链淀粉含量；C：淀粉直支比；****：与WT相比，差异极显著（P＜0.01）；ns：与WT相比，没有显著差异（P＞0.05）。
Figure 7. Starch content of progeny after genetic editing on OsSBE3
A: Amylose content; B: amylopectin content; C: amylose/amylopectin ratio; ****: extremely significant difference from WT (P＜0.01); ns: not significantly differ from WT (P＞0.05).
表 1 引物信息
Table 1 Information on primers applied
引物名称
Primer name引物序列（5′-3′）
Primer sequence (5′- 3′)用途
ApplicationYL-Hu-SBE3-Y1+ cagtGGTCTCatgcaGAGAGCAGCGACCGCGACGT 载体构建 Carrier construction YL-Hu-SBE3-Y1- cagtGGTCTCaaaacACGTCGCGGTCGCTGCTCTC 载体构建 Carrier construction YL-Hu-SBE3-B1+ cagtGGTCTCatgcaTTGCTCATGCGGTCTGCATTt 载体构建 Carrier construction YL-Hu-SBE3-B1- cagtGGTCTCaaaacAATGCAGACCGCATGAGCAA 载体构建 Carrier construction Pyl- ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGT 鉴定引物 Identification primer Pbw2- GCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG 鉴定引物 Identification primer Cas9-CL-F GAACGGTCGTAAGAGGATGC 无标记检测 Unmarked detection Cas9-CL-R GGTGATGGACTGGTGGATGAG 无标记检测 Unmarked detection SBE3-C-F TGAAGGTGTCACTTATCGAGAA 纯合突变检测 Homozygous mutation detection SBE3-C-R ACCACTGCGCTATACATGCGTT 纯合突变检测 Homozygous mutation detection HYG-F GGTGATGGACTGGTGGATGAG 鉴定引物 Identification primer HYG-R GGAAGTGCTTGACATTGGGGAGTTT 鉴定引物 Identification primer 32660-BA1-F GCGCACACCCACACACCGACCA 靶点1检测 Target 1 detection 32660-BA1-441Rg GCGAACGGCACCTGGACACGAGA 靶点1检测 Target 1 detection OsBE3_BA2_R ACCACTGCGCTATACATGCGTT 靶点2检测 Target 2 detection OsBE3_BA2_F TGAAGGTGTCACTTATCGAGAA 靶点2检测 Target 2 detection 黑色下划线表示Eco31 I/Bsa I酶切位点，小写斜体字母为酶切位点的保护碱基。
Black underline: Eco31 I/Bsa I cleaving site; lowercase italics: protective base of site.
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