Microbial Community in Fermented Forage Affected by Ingredients Used
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摘要:目的 液体发酵饲料有益于动物肠道健康，具有良好的应用前景。分析不同底物对液体发酵豆粕的理化特性和细菌群落的影响，为发酵饲料的开发利用提供参考。方法 采用正交试验分析红糖、鱼粉和豆粕及其组合，对液体发酵饲料品质的影响；采用16S rDNA测序，分析不同底物对细菌群落结构的影响。结果 液体发酵饲料外观与原料浓度相关，即原料浓度越大，发酵饲料颜色越深。添加豆粕和鱼粉提高了发酵液体中的有机质和氮含量。PCA分析显示发酵前后样本中具有完全不同的细菌群落结构。经发酵，液体饲料中的细菌种类和数量都有所增加。发酵初期，变形菌门细菌占主导，其中的优势属为黄单胞菌（Xanthomonas）；发酵结束后，厚壁菌门占主导，其中乳杆菌（Lactobacillus）和魏斯氏菌（Weissella）等乳酸菌是优势属。发酵底物是影响液体发酵饲料质量的重要因素，红糖与假单胞菌属（Pseudomonas）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、魏斯氏菌属（Weissella）、片球菌属（Pediococcus）和乳杆菌（Lactobacillales）含量呈正相关。鱼粉与乳杆菌属含量呈负相关，与嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、魏斯氏菌属和假单胞菌属呈正相关。豆粕含量与醋酸杆菌属（Acetobacter）、乳杆菌属、嗜冷杆菌属、魏斯氏菌属和片球菌属（Pediococcus）呈正相关。结论 添加较高水平的红糖和豆粕、低水平的鱼粉能够提高液体发酵饲料中乳杆菌和魏斯氏菌等益生菌的丰度。Abstract:Objective Effects of major ingredients used in formulating fermented livestock forage on probiotics in animals fed with it were analyzed.Method Brown sugar, fish meal, soybean meal, and their combinations were used to formulate liquid culture media in an orthogonal experiment. Structure and diversity of the microbial community in the fermentation broths were determined using the high throughput 16S rDNA sequencing technique.Result The fermentation broth became darker as the concentration increased. The addition of soybean or fish meal raised the contents of organic matters and nitrogen, and the fermentation significantly altered the microbial community with a much-enriched diversity and abundance of the broth. At the beginning of the fermentation, Proteobacteria was the predominant phylum with Xanthomonas being the outstanding genus. In the end, Firmicutes with genera Lactobacillus and Weissella became dominant. The microbial community was significantly affected by the ingredients included in the fermentation medium. For instance, brown sugar enhanced the proliferation of Pseudomonas,Xanthomonas, Weissella, Pediococcus, and Lactobacillales, fish meal facilitated that of Psychrobacter, Weissella, and Pseudomonas but inhibited Lactobacillales, while soybean meal promoted the growth of Acetobacter, Lactobacillales, Psychrobacter, Weissella, and Pediococcus.Conclusion It appeared that a culture medium high on brown sugar and soybean meal but low on fish meal could significantly enhance the abundance of Lactobacillus and Weissella in the fermentation broth to be use as a forage for feeding the livestock.
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0. 引言
【研究意义】随着我国无抗养殖技术的发展，液体发酵饲料备受关注。液体发酵饲料是饲料经过微生物发酵后的产物，富含益生菌，能够抑制动物肠道病原菌增殖，调节肠道微生态，改善动物健康状况[1-2]。作为抗生素和生长促进剂的理想替代品，液体发酵饲料具有良好的应用前景。液体饲料自然发酵过程中，原料中的土著微生物对发酵原料分解转化，其中的微生物包括乳酸菌、酵母菌等益生菌，也包含大肠杆菌、沙门氏菌等条件致病菌，存在安全隐患[3]。并且，自然发酵导致饲料中乙酸和生物胺浓度升高，降低维生素等必需营养物质的含量，影响饲料的适口性和营养价值[4]。添加微生物进行液体饲料发酵有助于饲料高效转化，产生大量乳酸等有机酸，抑制大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌，保障发酵饲料生物安全性[5]。研究表明，添加乳酸菌进行液体饲料发酵可以降低干物质损失率，同时抑制生物胺和植酸磷的生成[6]。液体饲料发酵增加了微生物与物料的接触面积，促进微生物增殖与物料转化。采用微生物进行豆粕液态发酵，可促进豆粕营养细化，提高饲料转化效率。【前人研究进展】液体发酵饲料中的微生物组成是评判其质量的重要标准。液体发酵饲料具有丰富的微生物组成，乳酸菌是其中的常见菌群，主要包括乳杆菌属、片球菌属、链球菌属、双歧杆菌属和明串珠均属的细菌，是常见的益生菌[7-8]。此外，芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌也是常用的饲用益生菌。发酵饲料中的益生菌及其代谢产物能够调节肠道微生态，提高动物免疫力[9]。饲用芽孢杆菌能够耐受胃酸和上消化道胆盐和消化液的破坏，抵达下消化道并定植生长，维持肠道厌氧环境和微生态平衡，产生胞外酶，促进饲料转化为更易消化吸收的小分子物质，提高饲料利用率[10-12]。【本研究切入点】芽孢杆菌抗逆性强，能以多种农副产品及工业副产物为底物，具有良好的应用前景。笔者前期采用芽孢杆菌进行豆粕固态发酵，提高饲料中魏斯氏菌属、乳杆菌属和乳酸片球菌属等乳酸菌的数量，降低肠杆菌属、葡萄球菌属和明串珠菌属等条件致病菌的含量[13]。然而，芽孢杆菌对豆粕液态发酵营养特性和微生物群落结构的影响尚需进一步研究。【拟解决的关键问题】本研究接种芽孢杆菌进行饲料液态发酵，采用正交试验分析红糖、鱼粉和豆粕及其组合方式，对液体发酵饲料品质和细菌群落结构的影响，以期为液体发酵饲料品质提升提供理论基础。
1. 试验材料
1.1 材料
供试菌株：芽胞杆菌FJAT-FB1（Bacillus subtilus FJAT-FB1），由本实验室分离保藏。
供试培养基为Luria-Bertani（LB）培养基：酵母提取物10.0 g，NaC1 5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，水1000 mL，pH 7.2~7.4。红糖、豆粕、鱼粉（市售）。
1.2 方法
1.2.1 液体发酵饲料制备
芽孢杆菌FJAT-FB1发酵液制备：选取芽孢杆菌单菌落至LB培养基中，35 ℃、180 r·min−1振荡培养12 h。4 ℃、2 000 r·min−1离心5 min，用超纯水重悬，调整至OD600为1.0。液体发酵饲料原料配制：设计正交试验，发酵原料红糖、鱼粉和豆粕按照表1添加。同时加入KH2PO4、MgSO4分别至终浓度为1 g·L−1和0.1 g·L−1，FJAT-FB1发酵液添加量为10%，添加蒸馏水至总体积为200 mL，置于250 mL的摇瓶，于30 ℃、170 r·min−1发酵7 d。各处理设置3组重复。
表 1 红糖、鱼粉和豆粕添加量的正交设计Table 1. Orthogonal experiment on forage formulation with brown sugar, fish meal, and soybean meal因素
Elements红糖
Brown sugar/%鱼粉
Fish meal/%豆粕
Soybean meal/%质量分数
Mass fraction/%处理1 a a a
Treatment 11 2 2 5 处理2 a b b
Treatment21 4 4 9 处理3 a c c
Treatment 31 16 8 25 处理4 b a b
Treatment 42 2 4 8 处理5 b b c
Treatment 52 4 8 14 处理6 b c a
Treatment 62 16 2 20 处理7 c a b
Treatment 74 2 4 10 处理8 c b a
Treatment 84 4 2 10 处理9 c c c
Treatment 94 16 8 28 1.2.2 发酵饲料理化特性检测
取10 g样本溶解至100 mL去离子水中，振荡混匀取上清，采用玻璃电极法测定pH。每个样本取10 mL，梯度稀释104倍，使用孔径为0.22 μm的除菌滤膜，获得发酵上清液，采用水质仪（HACH， NPW-160）检测有机质和总氮指标，每个样本设立3组重复取均值。
1.2.3 发酵饲料细菌群落变化
宏基因组DNA提取：称取500 mg离心后的发酵饲料沉淀物，按试剂盒FastDNA SPIN Kit for Soil操作，提取总DNA。DNA质量检测后，调整终浓度至1 ng·μL−1开展后续试验。微生物组16S rDNA V3-V4区测序：以上述DNA为模板，PCR扩增细菌16S rDNA V3-V4区片段，所用引物为338F（5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′）和806R（5′- GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′）。PCR产物纯化后构建paired-end（PE）文库（TruSeqTM DNA Sample Prep Kit建库试剂盒，Illumina公司），经过Qubit定量和文库检测，HiSeq上机测序（上海美吉）。PE300对测序所得数据拼接处理后，进一步采用Mothur软件（version 1.36.1）进行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类分析[14-15]。将OTU代表序列与已知物种的16S数据库（Silva，http://www.arb-silva.de）比对，进行物种注释。发酵饲料中的共有和独有的物种（如OTU）数目采用R语言（version 3.3.1）工具统计和作Venn图[16]。采用R语言（version 3.3.1）函数进行heatmap分析[17]。16S功能预测是采用PICRUSt（Phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）分析[18]。
2. 结果与分析
2.1 发酵饲料理化特性检测
经过7 d发酵后，液体饲料均呈现良好的色泽。S3、S6、S9液体发酵饲料底物浓度高，外观颜色较深（图1）；S1、S4、S7、S8底物浓度低，颜色较其他组更浅，液体发酵饲料颜色深浅与原料浓度有关。S2具有明显氨臭味，其他组具有明显的酸香味。
发酵过程中，pH呈现下降趋势（图2）。S2组pH下降缓慢，发酵7 d后降至6.2；S1、S4、S5和S9的pH下降明显，至发酵5 d，达到最低值，发酵第6天和第7 天呈现缓慢上升趋势，最终达4.5～4.6。液体发酵饲料上清液中有机质和总氮含量检测分析结果表明发酵后S2、S4、S6、S7和S9有机质含量升高，其中S2、S4和S7发酵后的有机质含量升至18.8%、17.9%和18.6%。饲料微粒在水中溶解的主要部分是含氮化合物，发酵前总氮含量检测结果表明，S5（1.28%）、S6（1.71%）和S9（2.30%）总氮含量高于其他组，添加豆粕和鱼粉提高了发酵液体中的氮含量（图2）。发酵7 d后，S5、S8和S9总氮含量分别升高至1.48%、1.82%和1.71%；其他组总氮含量均降低。S5、S8和S9发酵后具有明显的酸香味。
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图 2 液体发酵饲料pH（A）、有机质和总氮含量（B）变化Figure 2. Changes on pH (A) and organic matter and nitrogen contents (B) in fermentation broth2.2 发酵饲料细菌多样性评估
测序共获得5 002 663条序列，包含9个门，15纲，38目，65科，124属，187种细菌。测序覆盖率均在99.8%以上，能够准确反映发酵饲料中的细菌群落。群落丰富度相关的chao和sobs指数，范围分别为63（S8）~163.9（S4_7）和44（S8）~127（S4_7），即S8样本中的细菌丰富度最低，S4_7中细菌丰富度最高；香农指数和辛普森指数范围分别为0.368（S8）~2.522 （S2_7）和0.128（S3_7）-0.619（S5），发酵后的样本具有更高的细菌多样性（表2）。α-多样性分析结果表明，液体饲料发酵后的细菌种类和数量都有所增加。
表 2 液体发酵饲料 Aplha 多样性统计Table 2. α-diversity of microbial community in fermentation broth样本
SampelsChao指数
Chao
indexSobs指数
Sobs
index香农指数
Shannon
index辛普森指数
Simpson
index覆盖率
Coverage/%S1 83.1 60 1.318 0.330 99.93 S1_7 96.2 69 2.049 0.295 99.96 S2 98.0 52 0.969 0.520 99.94 S2_7 123.8 118 2.522 0.152 99.97 S3 109.0 63 1.082 0.398 99.95 S3_7 141.9 105 2.457 0.128 99.90 S4 85.9 74 0.650 0.653 99.96 S4_7 163.9 127 2.447 0.182 99.92 S5 100.2 75 0.786 0.619 99.94 S5_7 113.0 78 1.872 0.268 99.95 S6 83.0 48 0.895 0.502 99.96 S6_7 89.4 80 1.791 0.347 99.98 S7 97.5 60 0.782 0.505 99.96 S7_7 84.1 78 1.169 0.519 99.97 S8 63.0 44 0.368 0.852 99.96 S8_7 69.2 62 1.411 0.441 99.98 S9 68.0 51 1.156 0.397 99.97 S09_7 107.0 77 2.023 0.231 99.97 经发酵，液体饲料中的微生物种类增加，其中S2、S3和S4增幅显著，微生物种类增加至118、105和127。venn图显示发酵饲料中的共有和独有物种，发酵原料中有9类共有物种，发酵结束后的共有物种有8类（图3）。发酵过程促使S1、S2、S3、S4和S8中的独有物种类型增加，如S2 和S4中的独有物种分别由5类和12类增加至34类和23类；S5、S7和S9的独有物种类型分别由13、11和4类降至7、5和3类。
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图 3 液体发酵前（A）后（B）物种venn图Figure 3. Venn diagram denoting difference of OTUs before (A) and after (B) fermentation2.3 发酵饲料细菌群落结构
发酵原料中变形菌门细菌占主导，发酵后样本中厚壁菌门相对含量均高于82.8%，成为优势菌。发酵初期样本中主要优势属为黄单胞菌（Xanthomonas），发酵饲料S1～S9的含量分别为41.32%、68.90%、24.69%、78.71%、77.17%、63.63%、59.37%、92.34%、55.00%（图4）。微生物组成是影响液体发酵饲料质量的重要因素。发酵后豆粕中的优势菌为乳杆菌（Lactobacillus）和魏斯氏菌（Weissella），其中S1、S3、S4、S5、S6、S7、S9组中的乳杆菌含量分别为70.26%、28.44%、28.19%、36.60%、21.99%、72.64%、30.87%；S4、S5、S8、S9中的魏斯氏菌含量分别为40.56%、44.11%、66.65%、43.52%。
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图 4 液体发酵饲料细菌组成Figure 4. Relative abundance of predominant microbes in fermentation broth本研究采用芽孢杆菌作为起始菌株进行饲料液态发酵，处理S1、S4、S5、S7、S8和S9组的乳酸菌含量均高于70%。对这几组处理的发酵过程细菌群落分析显示，自发酵第2天乳酸菌含量开始升高（图5）。S1在发酵第4天，乳酸菌相对含量达87.9%；S4发酵至7 d，乳酸菌含量最高为74.8%；S5在第6天，乳酸菌含量达94.1%，至第7天降低88.1%；发酵第5 天，S7、S8和S9中的乳酸菌含量达到峰值，分别为85.6%、84.7%、96.3%，随着发酵时间的延长，其相对含量下降。综合发酵液体后期的pH和感官分析，处理S5和S9发酵后的乳酸菌含量最高，pH值低，气味酸香，发酵效果最好。S5和S9的乳酸菌含量分别在在发酵第6天和第5天达到峰值，S9所需发酵时间更短，为更适宜底物组合。
2.4 液体发酵饲料细菌群落差异
基于OTU分类水平的样本差异性分析显示，发酵原料聚成一类，位于PC1轴右侧，发酵后样本聚类于PC1轴左侧，发酵过程影响了样本细菌群落结构（图6）。发酵原料中，消化嗜冷杆菌属（Psychrobacter alimentarius）和柑橘黄单胞菌属（Xanthomonas citri）是优势菌，而发酵后其相对含量降低。发酵后的样本则聚为两类，一类位于PC轴左上方，包括S1、S2、S3、S6和S7；一类聚在左下方，包括S4、S5、S8和S9。
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图 6 基于OTUs分析的液体发酵样本PCA图Figure 6. PCA plot of different fermentation broths basing on OTUs经过7 d发酵，S2凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans，20.5%）和梭菌（33.8%）的相对含量最高，具有独特的细菌群落。S1和S7中的发酵乳酸杆菌（Lactobacillus fermentum）含量高，分别为52.6%和70.0%。S3和S6中酸鱼乳杆菌（Lactobacillus acidipiscis）、发酵乳杆菌和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）等产乳酸益生菌也是其优势菌。S4，S5，S8和S9中类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）是优势菌。酸鱼乳杆菌也是S4和S5中的优势菌，其在S5中的含量高达33.2%；S4中具有高含量的巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus，13.7%）。S8中的戊糖片球菌含量高达15.1%。S9中发酵乳杆菌（11.9%）和一种未分类乳杆菌（unclassified_ Lactobacillus，16.8%）也是其优势菌。
2.5 发酵底物对细菌群落结构的影响
发酵底物是影响液体发酵饲料质量和微生物组成的重要因素。红糖与假单胞菌属（Pseudomonas）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、魏斯氏菌属（Weissella）、片球菌属（Pediococcus）和乳杆菌（Lactobacillales）呈正相关（图7）。红糖中等含量（2%）的S4和S5中酸鱼乳杆菌和类肠膜魏斯氏菌是优势菌是优势菌，高含量组（4%）S8和S9中类肠膜魏斯氏菌是优势菌。鱼粉与乳杆菌属含量呈负相关，与嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、魏斯氏菌属和假单胞菌属呈正相关。低水平鱼粉添加组（2%）的S1和S7中的乳杆菌为绝对优势菌，其含量分别为70.3%和72.6%，其中发酵乳杆菌含量高达52.6%和69.9%。高水平鱼粉添加（16%）的S3和S6中的乳杆菌含量低（28.4%和22.0%），而严格梭菌属占比分别升至19.2%和61.4%。豆粕含量与醋酸杆菌属（Acetobacter）、乳杆菌属、嗜冷杆菌属、魏斯氏菌属和片球菌属（Pediococcus）呈正相关。豆粕含量较高的S4、S5和S9组中的乳杆菌和魏斯氏菌均为优势菌，推测豆粕发酵可以选择乳酸杆菌和魏斯氏菌为优势菌。因此，推测添加较高水平的红糖（2%、4%）和豆粕（4%、8%）、低水平的鱼粉（2%、4%）能够提高液体发酵饲料中乳杆菌和魏斯氏菌等益生菌的丰度。
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图 7 发酵底物与优势菌属间的相关性热图Figure 7. Heatmap of correlation between ingredients used and dominant microbes in fermentation broth红糖和豆粕含量与魏斯氏菌和片球菌协同正相关。当豆粕含量为2%时，红糖含量从1%（S1）升至2%（S6）和4%（S8），魏斯氏菌和片球菌含量升高；而鱼粉含量从2%升至16%，魏斯氏菌和片球菌含量持续降低。当豆粕含量为4%时，红糖含量从1%（S2）升至2%（S4）和4%（S7），乳杆菌含量由0.94%升至72.6%。当豆粕含量为8%时，降低鱼粉含量，提高了魏斯氏菌和乳杆菌的相对含量。当红糖含量为1%，随着鱼粉和豆粕含量的升高，梭菌属和魏斯氏菌含量升高，即鱼粉和豆粕含量与梭菌属和魏斯氏菌和乳杆菌协同正相关。当红糖含量为2%时，添加4%鱼粉和8%豆粕，乳杆菌（36.6%）和魏斯氏菌（44.1%）含量最高，乳杆菌和魏斯氏菌含量随着鱼粉（16%）增加和豆粕（2%）的减少而降低，乳杆菌和魏斯氏菌含量随鱼粉含量变化呈现先升后降的趋势。当红糖含量为4%时，添加2%鱼粉和4%豆粕，乳杆菌含量高达72.6%；添加4%鱼粉和2%豆粕，魏斯氏菌含量高达66.6%；而添加16%鱼粉和8%豆粕，魏斯氏菌和乳杆菌的含量分别为43.5%和30.9%，即魏斯氏菌含量随鱼粉含量变化呈现先升后降，乳杆菌含量随豆粕含量变化先升后降。
3. 讨论与结论
3.1 发酵饲料理化特性分析
本研究设计正交试验分析不同底物对液体发酵饲料品质及细菌群落结构的影响。添加不同浓度红糖、豆粕和鱼粉影响发酵饲料中有机质和氮的含量。饲料液态发酵过程产生热量导致水分散失，可能是导致有机质含量升高的主要原因。饲料微粒在水中溶解的主要部分是含氮化合物，添加豆粕和鱼粉提高了发酵液体中的氮含量。蛋白质类物质在降解过程中产生胺类物质，进一步生成氨气等含氮气体，造成发酵液体氮素损失，降低总氮含量。S5、S8和S9发酵后具有明显的酸香味，而无氨臭味，因氨气挥发引发的氮流失率较低，故而氮含量较高。
3.2 发酵饲料细菌多样性分析
添加不同底物引起细菌群落结构的差异。液体饲料发酵后的细菌种类和数量都有所增加。发酵初期，变形菌门细菌占主导，发酵后厚壁菌门相对含量高于82.8%，成为优势菌。在属水平，发酵后豆粕中的优势菌为乳杆菌和魏斯氏菌。乳杆菌和魏斯氏菌是食品发酵中的重要微生物。乳杆菌产生大量乳酸，抑制病原微生物生长，同时增加饲料适口性，提高食品的质量和营养，其含量也是评价发酵效果的重要指标 [19-20]。魏斯氏菌是一类重要的乳酸菌，存在于酱油、豆豉和香肠等发酵食品中，产生乳酸、短链脂肪酸和低聚糖等，增加食品风味[21-22]。液体饲料发酵后，片球菌属（Pediococcus）的相对含量增加，其中S3和S8中的含量分别高达21.0%和15.6%。片球菌也是发酵食品中的常见菌株，能够产生多种具有抑菌活性的片球菌素，延长发酵食品的保存期[23]。乳酸菌能够产生乳酸，广泛应用于食品发酵、青贮、生物防治和防腐等[24]。发酵后液体饲料微生物组成丰富，乳杆菌属、魏斯氏菌、片球菌属、乳酸球菌属（Lactococcus）等乳酸菌含量高，为优势菌。
3.3 发酵饲料细菌差异性分析
发酵过程形成了与起始阶段截然不同的细菌群落结构。发酵原料中嗜冷杆菌属是优势菌，其含量随发酵而降低。发酵后的S1、S2、S3、S6和S7具有相似的细菌群落结构：S2凝结芽孢杆菌（20.5%）和梭菌（33.8%）的相对含量最高，具有独特的细菌群落；S1和S7中的发酵乳酸杆菌含量分别高达52.6%和70.0%；S3和S6中的梭菌含量较高。凝结芽孢杆菌是优良的益生菌，能够耐受胃肠道极端环境，产生乳酸等有益代谢物，抑制肠道有害菌，促进营养物质消化吸收，具有芽孢杆菌和乳酸菌的双重益生作用[25]。梭菌是严格厌氧异养菌，于动物肠道中常驻菌，具有益生特性，也广泛应用于食品制造和工业发酵中[26]。同时酸鱼乳杆菌、发酵乳杆菌和戊糖片球菌等产乳酸益生菌也是其优势菌。发酵乳杆菌生长繁殖性能良好，对哺乳动物的消化功能和免疫功能具体促进效果，是常见饲用益生菌[27]。酸鱼乳杆菌多存在于发酵食品中，如奶酪和发酵鱼类食品，能够利用葡萄糖发酵产生乳酸[28-29]。作为食品添加剂，戊糖片球菌能够改良食物口味，提高营养价值，延长保存期；作为优良的益生菌，戊糖片球菌具有良好的抗炎、抗癌、抗氧化和降脂能力[23]。另一类样本包括S4、S5、S8和S9，类肠膜魏斯氏菌是其优势菌，类肠膜魏斯氏菌具有良好的抑菌和抗氧化能力，提升发酵食品的风味和品质[30]。S4和S5也含有大量酸鱼乳杆菌，其中S5中的含量高达33.2%，酸鱼乳杆菌也是S4和S5中的优势菌，其在S5中的含量高达33.2%；S4中具有高含量的巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus，13.7%）。巴氏醋酸杆菌能够好氧发酵产生醋酸和酯类物质，改善食品风味[31]。此外S4中巴氏醋酸杆菌高达13.7%，醋酸菌和乳酸菌共培养能够提高功能性物质乙偶姻的含量，丰富食品风味和香气[32]。在液体饲料发酵过程中，醋酸菌和乳酸菌的共存可提高液体饲料营养价值，提升其风味。而S8和S9中的酸鱼乳杆菌丰度很低，但具有高丰度的严格梭菌，此外S8中的戊糖片球菌含量高达15.1%，S9中发酵乳杆菌（11.9%）和一种未分类乳杆菌（16.8%）也是其优势菌。液体发酵多样性的细菌组成有助于改善发酵饲料风味，提升营养价值。
发酵底物是影响液体发酵饲料质量的重要因素。相关性分析显示红糖与假单胞菌属、黄单胞菌属、魏斯氏菌属、片球菌属和乳杆菌含量呈正相关。鱼粉与乳杆菌属含量呈负相关，与嗜冷杆菌属、魏斯氏菌属和假单胞菌属呈正相关。豆粕含量与醋酸杆菌属、乳杆菌属、嗜冷杆菌属、魏斯氏菌属和片球菌属呈正相关。综上，添加高水平的红糖（2%和4%）和豆粕（4%和8%）能够提高液体发酵饲料中乳杆菌和魏斯氏菌等益生菌的丰度。本研究揭示了不同发酵底物对为液体发酵饲料品质和细菌多样性的影响，为液体发酵饲料提升奠定了理论基础。
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图 2 液体发酵饲料pH（A）、有机质和总氮含量（B）变化
Figure 2. Changes on pH (A) and organic matter and nitrogen contents (B) in fermentation broth
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图 3 液体发酵前（A）后（B）物种venn图
Figure 3. Venn diagram denoting difference of OTUs before (A) and after (B) fermentation
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图 4 液体发酵饲料细菌组成
Figure 4. Relative abundance of predominant microbes in fermentation broth
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图 6 基于OTUs分析的液体发酵样本PCA图
Figure 6. PCA plot of different fermentation broths basing on OTUs
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图 7 发酵底物与优势菌属间的相关性热图
Figure 7. Heatmap of correlation between ingredients used and dominant microbes in fermentation broth
表 1 红糖、鱼粉和豆粕添加量的正交设计
Table 1 Orthogonal experiment on forage formulation with brown sugar, fish meal, and soybean meal
因素
Elements红糖
Brown sugar/%鱼粉
Fish meal/%豆粕
Soybean meal/%质量分数
Mass fraction/%处理1 a a a
Treatment 11 2 2 5 处理2 a b b
Treatment21 4 4 9 处理3 a c c
Treatment 31 16 8 25 处理4 b a b
Treatment 42 2 4 8 处理5 b b c
Treatment 52 4 8 14 处理6 b c a
Treatment 62 16 2 20 处理7 c a b
Treatment 74 2 4 10 处理8 c b a
Treatment 84 4 2 10 处理9 c c c
Treatment 94 16 8 28 
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表 2 液体发酵饲料 Aplha 多样性统计
Table 2 α-diversity of microbial community in fermentation broth
样本
SampelsChao指数
Chao
indexSobs指数
Sobs
index香农指数
Shannon
index辛普森指数
Simpson
index覆盖率
Coverage/%S1 83.1 60 1.318 0.330 99.93 S1_7 96.2 69 2.049 0.295 99.96 S2 98.0 52 0.969 0.520 99.94 S2_7 123.8 118 2.522 0.152 99.97 S3 109.0 63 1.082 0.398 99.95 S3_7 141.9 105 2.457 0.128 99.90 S4 85.9 74 0.650 0.653 99.96 S4_7 163.9 127 2.447 0.182 99.92 S5 100.2 75 0.786 0.619 99.94 S5_7 113.0 78 1.872 0.268 99.95 S6 83.0 48 0.895 0.502 99.96 S6_7 89.4 80 1.791 0.347 99.98 S7 97.5 60 0.782 0.505 99.96 S7_7 84.1 78 1.169 0.519 99.97 S8 63.0 44 0.368 0.852 99.96 S8_7 69.2 62 1.411 0.441 99.98 S9 68.0 51 1.156 0.397 99.97 S09_7 107.0 77 2.023 0.231 99.97
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[1] XIN H L, WANG M Y, XIA Z, et al. Fermented diet liquid feeding improves growth performance and intestinal function of pigs [J]. Animals, 2021, 11(5): 1452. DOI: 10.3390/ani11051452
[2] MISSOTTEN J A M, MICHIELS J, OVYN A, et al. Fermented liquid feed for pigs [J]. Archives of Animal Nutrition, 2010, 64(6): 437−466. DOI: 10.1080/1745039X.2010.512725
[3] CULLEN J T, LAWLOR P G, CORMICAN P, et al. Microbial quality of liquid feed for pigs and its impact on the porcine gut microbiome [J]. Animals, 2021, 11(10): 2983. DOI: 10.3390/ani11102983
[4] O'MEARA F M, GARDINER G E, CLARKE D, et al. Microbiological assessment of liquid feed for finisher pigs on commercial pig units [J]. Journal of Applied Microbiology, 2021, 130(2): 356−369. DOI: 10.1111/jam.14785
[5] O' MEARA F M, GARDINER G E, O' DOHERTY J V, et al. Effect of wet/dry, fresh liquid, fermented whole diet liquid, and fermented cereal liquid feeding on feed microbial quality and growth in grow-finisher pigs [J]. Journal of Animal Science, 2020, 98(6): skaa166. DOI: 10.1093/jas/skaa166
[6] LAU N, HUMMEL J, KRAMER E, et al. Fermentation of liquid feed with lactic acid bacteria reduces dry matter losses, lysine breakdown, formation of biogenic amines, and phytate-phosphorus [J]. Translational Animal Science, 2022, 6(1): txac007. DOI: 10.1093/tas/txac007
[7] 李汶涛, 刘阳, 王力, 等. 液体发酵饲料及其在生猪生产中的应用研究进展 [J]. 中国畜牧杂志, 2021, 57(S1):15−20. LI W T, LIU Y, WANG L, et al. Research progress of liquid fermented feed and its application in pig production [J]. Chinese Journal of Animal Science, 2021, 57(S1): 15−20.(in Chinese)
[8] 许镨文, 李元晓, 庞有志. 液体发酵饲料对断奶仔猪肠道健康的影响 [J]. 动物营养学报, 2011, 23(12):2105−2108. XU P W, LI Y X, PANG Y Z. Fermented liquid feed: Effects on weaner piglet intestinal health [J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2011, 23(12): 2105−2108.(in Chinese)
[9] MISSOTTEN J A, MICHIELS J, DEGROOTE J, et al. Fermented liquid feed for pigs: An ancient technique for the future [J]. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2015, 6(1): 4. DOI: 10.1186/2049-1891-6-4
[10] KAEWTAPEE C, BURBACH K, TOMFORDE G, et al. Effect of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis supplementation in diets with low- and high-protein content on ileal crude protein and amino acid digestibility and intestinal microbiota composition of growing pigs [J]. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2017, 8: 37. DOI: 10.1186/s40104-017-0168-2
[11] HE Y J, KIM K, KOVANDA L, et al. Bacillus subtilis: A potential growth promoter in weaned pigs in comparison to carbadox [J]. Journal of Animal Science, 2020, 98(9): skaa290. DOI: 10.1093/jas/skaa290
[12] BLAVI L, JØRGENSEN J N, STEIN H H. Effects of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis on ileal digestibility of AA and total tract digestibility of CP and gross energy in diets fed to growing pigs [J]. Journal of Animal Science, 2019, 97(2): 727−734. DOI: 10.1093/jas/sky432
[13] 陈倩倩, 刘波, 王阶平, 等. 添加芽孢杆菌对豆粕固体发酵的影响 [J]. 中国粮油学报, 2020, 35(12):101−107. DOI: 10.3969/j.issn.1003-0174.2020.12.017 CHEN Q Q, LIU B, WANG J P, et al. Effects of Bacillus on solid state fermentation of soybean meal [J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2020, 35(12): 101−107.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1003-0174.2020.12.017
[14] HU Q, GUO X, LIANG Y L, et al. Comparative metagenomics reveals microbial community differentiation in a biological heap leaching system [J]. Research in Microbiology, 2015, 166(6): 525−534. DOI: 10.1016/j.resmic.2015.06.005
[15] MA J X, WANG Z W, LI H, et al. Metagenomes reveal microbial structures, functional potentials, and biofouling-related genes in a membrane bioreactor [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 100(11): 5109−5121. DOI: 10.1007/s00253-016-7312-3
[16] PARKS D H, BEIKO R G. Identifying biologically relevant differences between metagenomic communities [J]. Bioinformatics, 2010, 26(6): 715−721. DOI: 10.1093/bioinformatics/btq041
[17] JAMI E, ISRAEL A, KOTSER A, et al. Exploring the bovine rumen bacterial community from birth to adulthood [J]. The ISME Journal, 2013, 7(6): 1069−1079. DOI: 10.1038/ismej.2013.2
[18] LANGILLE M G I, ZANEVELD J, CAPORASO J G, et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences [J]. Nature Biotechnology, 2013, 31(9): 814−821. DOI: 10.1038/nbt.2676
[19] SLATTERY C, COTTER P D, O'TOOLE P W. Analysis of health benefits conferred by Lactobacillus species from kefir [J]. Nutrients, 2019, 11(6): 1252. DOI: 10.3390/nu11061252
[20] NAZAR M, WANG S R, ZHAO J, et al. The feasibility and effects of exogenous epiphytic microbiota on the fermentation quality and microbial community dynamics of whole crop corn [J]. Bioresource Technology, 2020, 306: 123106. DOI: 10.1016/j.biortech.2020.123106
[21] 李巧玉, 陈坚, 曾伟主, 等. 酱醪中魏斯氏菌的分离及特性分析 [J]. 微生物学通报, 2018, 45(11):2449−2462. LI Q Y, CHEN J, ZENG W Z, et al. Isolation and characterization of Weissella strains from soy sauce moromi mash [J]. Microbiology China, 2018, 45(11): 2449−2462.(in Chinese)
[22] STURINO J M. Literature-based safety assessment of an agriculture- and animal-associated microorganism: Weissella confusa [J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2018, 95: 142−152. DOI: 10.1016/j.yrtph.2018.03.013
[23] JIANG S M, CAI L Z, LV L X, et al. Pediococcus pentosaceus, a future additive or probiotic candidate [J]. Microbial Cell Factories, 2021, 20(1): 45. DOI: 10.1186/s12934-021-01537-y
[24] LÜBECK M, LÜBECK P S. Application of lactic acid bacteria in green biorefineries [J]. FEMS Microbiology Letters, 2019, 366(3): fnz024.
[25] 刘彬, 粟胜兰, 张雅惠, 等. 饲用凝结芽孢杆菌的菌种特性及作用机制 [J]. 饲料工业, 2022, 43(5):40−44. LIU B, SU S L, ZHANG Y H, et al. Strain property and action mechanism of Bacillus coagulans in feed [J]. Feed Industry, 2022, 43(5): 40−44.(in Chinese)
[26] 聂俊辉, 王通, 曾静, 等. 抽气负压发酵法对丁酸梭菌生长及芽孢形成的影响 [J]. 中国饲料, 2022(5):23−27. NIE J H, WANG T, ZENG J, et al. The effect of suctioned negative pressure fermentation on the growth and spore formation of Clostridium butyricum [J]. China Feed, 2022(5): 23−27.(in Chinese)
[27] 郭元晟, 闫素梅, 张和平, 等. 发酵乳酸杆菌对肉鸡胰腺和小肠消化酶活性及营养物质消化率的影响 [J]. 动物营养学报, 2011, 23(7):1225−1232. GUO Y S, YAN S M, ZHANG H P, et al. Effects of Lactobacillus fermentum supplementation on enzyme activities in pancreas and small intestine and nutrient digestibility in broilers [J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2011, 23(7): 1225−1232.(in Chinese)
[28] KAZOU M, ALEXANDRAKI V, BLOM J, et al. Comparative genomics of Lactobacillus acidipiscis ACA-DC 1533 isolated from traditional Greek kopanisti cheese against species within the Lactobacillus salivarius clade [J]. Frontiers in Microbiology, 2018, 9: 1244. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01244
[29] NASER S M, VANCANNEYT M, HOSTE B, et al. Lactobacillus cypricasei Lawson et Al. 2001 is a later heterotypic synonym of Lactobacillus acidipiscis Tanasupawat et Al. 2000[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2006, 56(Pt 7): 1681－1683.
[30] PABARI K, PITHVA S, KOTHARI C, et al. Evaluation of probiotic properties and prebiotic utilization potential of Weissella paramesenteroides isolated from fruits [J]. Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2020, 12(3): 1126−1138. DOI: 10.1007/s12602-019-09630-w
[31] ZHENG Y, CHANG Y G, XIE S K, et al. Impacts of bioprocess engineering on product formation by Acetobacter pasteurianus [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2018, 102(6): 2535−2541. DOI: 10.1007/s00253-018-8819-6
[32] 贾瑞娟, 陈旭峰, 胡开燕, 等. 山西老陈醋优良芽孢菌与醋酸菌、乳酸菌的相互作用 [J]. 中国食品学报, 2021, 21(9):57−70. JIA R J, CHEN X F, HU K Y, et al. Interaction of excellent Bacillus, acetic acid bacteria and lactic acid bacteria isolated from cupei of Shanxi aged vinegar [J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2021, 21(9): 57−70.(in Chinese)
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1. 姜丽丽. 发酵液体饲料在猪生产中的应用研究进展. 今日养猪业. 2024(02): 8-12 . 
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