Bioinformatics and Expression of CaTPS9 in Chili Peppers
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摘要:目的 明确辣椒中海藻糖-6-磷酸合酶（TPS）基因CaTPS9的表达特性和生物学功能，进一步了解TPS对辣椒生长中调控非生物胁迫的作用。方法 以辣椒品种强丰101为试验材料，克隆CaTPS9基因，并对辣椒CaTPS9的理化性质、蛋白结构、顺式作用元件、系统进化树等进行分析；通过qRT-PCR分析CaTPS9基因在不同组织（商品果果肉、幼果果肉、成熟果果肉、商品果胎座、幼果胎座、成熟果胎座、叶、根、茎、花）和胁迫处理（低温和植物生长调节剂处理）中的表达模式。结果 CaTPS9基因CDS序列全长2604 bp，编码867个氨基酸。CaTPS9蛋白包含Glyco_transf_20和Trehalose_PPase两个保守结构域，分子质量为97.60 kDa，不稳定指数为44.27，理论等电点为5.63，亚细胞定位预测CaTPS9蛋白位于细胞质中。生物信息学分析表明，CaTPS9蛋白属于亲水性蛋白，且不存在跨膜结构和信号肽序列，蛋白结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。系统进化关系分析表明，CaTPS9与烟草（Nicotiana tabacum L.）、番茄（Solanum lycopersicum L.）和马铃薯（Solanum tuberosum L.）中的同源基因亲缘关系较近。启动子顺式作用元件分析表明，CaTPS9启动子区域含有与激素、胁迫及植物生长发育相关的顺式作用元件。此外，CaTPS9在叶片中表达量最高，在商品果胎座中表达量最低。在水杨酸（Salicylic acid，SA） 处理12 h后CaTPS9基因的表达量被显著提升，而低温、吲哚乙酸（3-indoleacetic acid，IAA）、脱落酸（Abscisic acid，ABA）、赤霉素（Gibberellin acid，GA3）和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）处理能够显著抑制CaTPS9基因表达量。结论 CaTPS9基因可能通过海藻糖生物合成途径响应逆境胁迫。
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关键词:
- 辣椒 /
- 海藻糖-6-磷酸合酶 /
- 生物信息学 /
- 非生物胁迫 /
- 表达分析
Abstract:Objective Bioinformatics and expression of trehalose-6-phosphate synthase (TPS) gene in chili peppers,CaTPS9, were studied to understand its role in response to abiotic stress during the plant growth.Method CaTPS9 was cloned from Qiangfeng 101 to analyze the physicochemical properties, protein structure, cis-regulatory element, and phylogenetic tree. Expressions of the gene in the pericarp and placenta of a commercial pepper as well as the young pericarp, ripened pericarp, young placenta, ripened placenta, leaves, roots, stems, and flowers of chili pepper plants under varied stresses including low temperature, 3-indoleacetic acid(IAA), abscisic acid(ABA), salicylic acid(SA), gibberellin A3(GA3), and methyl jasmonate(MeJA) were determined using qRT PCR.Result The full-length cDNA sequence of CaTPS9 was 2604 bp encoded 867 amino acids. Located in the cytoplasm, the protein contained two conserved domains, Glyco_transf_20 and Trehalose_PPase, with a molecular weight of 97.60 kDa, an instability index of 44.27, and a theoretical isoelectric point of 5.63. It was a hydrophilic protein free of transmembrane structure and signal peptide sequence with a structure consisting mainly of alpha helixes and random coils. Phylogenetically, CaTPS9 was close to the homologous genes in Nicotiana tabacum, Solanum lycopersicum and Solanum tuberosum. It had hormones response, stress response, and plant growth and development cis−elements and was expressed most highly in the leaves, lowly in the placentas of a commercially available pepper, and significantly by 12 h SA induction. Stress, such as low temperature, IAA, ABA, GA3, and MeJA, significantly inhibited the expression.Conclusion It appeared that CaTPS9 might regulate the response of chili pepper plants to various abiotic stresses through the trehalose biosynthetic pathway.-
Keywords:
- Chili pepper /
- TPS /
- bioinformatics /
- abiotic stress /
- expression analysis
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0. 引言
【研究意义】辣椒（Capsicum annuum L.）属于一年生蔬菜作物，具有十分重要的经济价值和社会效益。我国辣椒的种植面积在蔬菜作物中位居首位，占全国蔬菜种植面积的10%左右[1]。然而，植物体在生长发育过程中会受到生物胁迫和非生物因子的影响，导致其品质和产量降低。因此，研究辣椒响应逆境胁迫的分子机理对辣椒分子遗传改良具有重要意义。海藻糖（Trehalose）是一种非还原性双糖，在大多数植物体内含量较少，但在非生物胁迫条件下会大量积累[2-3]。海藻糖通过保护和稳定蛋白质和细胞膜[4-5]、提高渗透调节作用[6]、参与信号转导等作用机制[7]，可以有效提高植物对非生物胁迫的抗性。在海藻糖合成和代谢途径中，海藻糖-6-磷酸合成酶（Trehalose-6-phosphate-Synthase，TPS）催化葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate，G6P）和尿苷二磷酸葡萄糖（Uridne diphosphate glucosa，UDP-Glc）形成6-磷酸海藻糖（Trehalose-6-phosphate，T6P），海藻糖-6-磷酸磷酸酶（Trehalose-phosphate phosphatase，TPP）催化T6P去磷酸化产生游离的海藻糖，最终被海藻糖酶（Trehalase，TRE）水解产生两分子葡萄糖[8]。TPS是海藻糖合成途径中第一步所需的关键酶，其含量的变化与海藻糖含量有着直接关系[9-10]。【前人研究进展】研究表明，TPS基因在植物生长发育和响应逆境胁迫中起着重要作用[9]。截至目前，TPS基因家族已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）[11]、水稻（Oryza sativa）[12]、番茄（Solanum lycopersicum）[13]、辣椒（Capsicum annuum）[14]、葡萄（Vitis vinifera）[15]等物种中被鉴定。拟南芥AtTPS5 负调控脱落酸（Abscisic acid，ABA）信号传导，并参与改变海藻糖含量和硝酸还原酶（Nitrate reductase，NR）活性[7]。在水稻中，过表达OsTPS1 基因可以增加海藻糖和脯氨酸的含量，以及调节胁迫相关基因的表达，进而增强水稻对非生物胁迫耐受性[9]。小麦TPS转基因植株的抗旱性、耐盐能力得到提高[16]。番茄TPS1转基因植株与野生型相比对盐、干旱和氧化应激胁迫的耐受性显著增强[17]。此外，TPS基因在植物不同组织中的表达存在差异[13，15]。这些研究表明，TPS基因可以增强植物对非生物胁迫的抗逆性。【本研究切入点】目前关于TPS基因在辣椒中的组织表达模式以及对各种非生物胁迫响应的表达特性还鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究对CaTPS9 基因进行生物信息学分析，并通过qRT-PCR分析其在不同组织和处理中的表达模式以及对各种非生物胁迫响应的表达特性，为进一步研究CaTPS基因的功能及辣椒抗逆性的分子机理提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
本研究用于CaTPS9基因克隆和表达模式分析的辣椒材料为强丰101，由甘肃农业大学园艺学院分子育种实验室提供。
1.2 试验方法
1.2.1 试验材料处理
选择籽粒饱满的辣椒强丰101种子，进行55 ℃温汤浸种30 min，将种子置于20%磷酸三钠消毒20 min，将消毒后的种子置于28 ℃培养箱中催芽，待种子发芽后播种于穴盘中。
将播种后的穴盘放置于人工气候培养箱中，培养条件为28 ℃/23 ℃（白天/黑夜），光周期为16 h/8 h （光照/黑暗），相对湿度为60%，光照强度为12000 lx。待辣椒果实生长至成熟期时取根、茎、叶、花、幼果胎座、商品果胎座、成熟果胎座、幼果果肉、商品果果肉和成熟果果肉等样品，立即放入液氮中冷冻后置于−80 ℃冰箱保存[18]，用于CaTPS9组织特异性表达。
低温处理：待辣椒幼苗长至6片真叶时挑选长势一致的植株进行8 ℃低温处理，在处理0、1、3、6、12、24、48、72 h时分别采集植株第4至第6片真叶的样品，液氮速冻后置于−80 ℃冰箱保存。
植物生长调节剂处理：辣椒种子消毒催芽后采用无土栽培技术培养在Hoagland营养液中，置于光照培养箱中生长，培养条件同上。待辣椒幼苗长至6片真叶时，选取长势一致的植株分别向Hoagland营养液中加入0.2 mol·L−1吲哚乙酸（Indole acetic acid，IAA）、0.6 mol·L−1 脱落酸（Abscisic acid，ABA）、0.6 mol·L−1 赤霉素（Gibberellin acid，GA3）、2 mol·L−1 水杨酸（Salicylic acid，SA）和0.1 mol·L−1 茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）进行植物生长调节剂处理，同时对照组仅用Hoagland营养液处理。在处理0、1、3、6、12、24、48、72 h时分别取植株第4至第6片真叶的样品，液氮速冻、−80 ℃超低温冰箱保存。
1.2.2 生物信息学分析
利用NCBI-CDD进行CaTPS9保守结构域分析[19]，蛋白质的理化性质和亚细胞定位通过ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）[20]和Euk-mPLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）[21]在线软件进行预测。使用NCBI中的BLASTP工具获取其他物种中与CaTPS9蛋白序列同源性较高的序列[22]，用ClustalX进行序列比对[23]，蛋白跨膜结构使用TMHMM 2.0在线网站进行预测（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）[24]。使用SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[25]和NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）[26]进行蛋白信号肽和蛋白磷酸化预测。蛋白二级结构和三级结构由SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html）[27]和SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）进行预测[28]。采用邻近法（Neighbor-joining method，NJ）在MEGA 10.1.7 软件中构建系统发育树，Bootstrap 设置为1000[29]。使用PlantCARE在线网站进行启动子顺式作用元件分析[30]。
1.2.3 CaTPS9基因克隆
根据茄科基因组数据库（https://solgenomics.net）下载CaTPS9基因序列信息，利用Primer Premier 5.0 软件设计引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。RNA提取按照TianGen 总RNA提取试剂盒说明书进行（天根，北京），反转录试剂盒PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成单链cDNA（宝生物，北京）。以cDNA为模板使用CaTPS9克隆引物进行PCR，反应体系：PrimeSTAR HS （Premix） 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL 和上下游引物各1 μL。反应程序：98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸2 min 40 s，35个循环，4 ℃保存。PCR产物用10 g·L−1琼脂糖凝胶电泳进行电泳检测，切胶回收符合要求的片段。使用pMD™18-T Vector Cloning Kit（宝生物，北京）将纯化片段与pMD 18-T载体连接后转化至大肠杆菌TreliefTM 5α感受态细胞（擎科，北京），涂布于含有100 mg·mL−1氨苄青霉素的LB固体平板，置于37 ℃培养箱中倒置培养。经菌落PCR鉴定后挑取阳性克隆送至擎科生物技术有限公司（西安）进行测序，获得CaTPS9基因序列。
表 1 CaTPS9基因引物信息及功能Table 1. Information and function of CaTPS9 primer引物名称
Primer name引物序列
Primer sequence（5′-3′）用途
PurposeCaTPS9-F ATGGCATCAAGATCTAGTGCA 基因扩增
Gene amplificationCaTPS9-R TTACCCACTCAAATTAACAGATGAG qCaTPS9-F GCATTGGAGATGACAGGTCGGATG 荧光定量PCR
qRT-PCRqCaTPS9-R ACTTGGCTTTGCTTGGCTTTTGC qActin-F AGAGATTCCGTTGCCCAGAGGTC 内参基因
Reference geneqActin-R AGCCACCACTGAGCACAATGTTAC 1.2.4 CaTPS9基因表达模式分析
按照TianGen 总RNA提取试剂盒说明书提取辣椒不同组织和不同胁迫、植物生长调节剂处理样品总RNA，并使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix合成单链 cDNA[天根生化科技（北京）有限公司]。选择辣椒Actin （GenBank登录号：GQ339766.1） 为内参基因（表1），使用SuperReal PreMix Plus试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]在StepOnePlus（美国应用生物系统中国公司产品）仪器上进行qRT-PCR反应。qRT-PCR反应体系：SYBR Green Master mix 10 μL，ddH2O 6 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 2 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，40个循环。CaTPS9基因的相对表达量采用2−△△Ct公式计算[31]。
1.3 数据处理
使用SPSS 25 进行显著性分析（P＜0.05），GraphPad Prism 9软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 辣椒CaTPS9基因的克隆与序列分析
以辣椒强丰101叶片cDNA为模板，使用CaTPS9-F/CaTPS9-R引物进行PCR扩增测序后得到全长为2 604 bp的序列（图1）。CaTPS9编码867个氨基酸，含有TPS家族保守结构域TPS（Glyco_transf_20）和TPP（Trehalose_PPase），进一步表明克隆到的基因为CaTPS9。理化性质分析结果表明，CaTPS9蛋白分子式为C4376H6799N1157O1288S43，分子质量为97.60 kDa，不稳定指数为44.27，推测其为不稳定蛋白，理论等电点为5.63，正电荷残基数量为91个，负电荷残基数为113个。亚细胞定位预测CaTPS9蛋白位于细胞质。
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图 1 CaTPS9基因扩增产物M：GL DNA Marker 5000，1～2：PCR产物。Figure 1. Amplification products of CaTPS9M: DNA marker 5000; 1-2: amplified cDNA product of CaTPS9.2.2 CaTPS9蛋白结构分析
对CaTPS9蛋白的疏水性/亲水性、磷酸化位点、二级结构和三级结构进行预测。结果表明：该蛋白属于亲水性蛋白（图2）并且不存在跨膜结构和信号肽序列，含有76个丝氨酸、32个苏氨酸、35个酪氨酸和磷酸化位点（图3），二级结构依次为α-螺旋（42.79%）、无规则卷曲（34.72%）、延伸链（17.30%）和β-转角（5.19%）（图4），三级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主（图5）。
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图 2 CaTPS9蛋白疏水性和亲水性预测Figure 2. Predicted hydrophobicity and hydrophilicity of CaTPS9 protein![]()
图 4 CaTPS9蛋白的二级结构预测蓝色区域表示α-螺旋；紫色区域表示无规则卷曲；红色区域表示延伸链；绿色区域表示β-转角。Figure 4. Predicted secondary structure of CaTPS9 proteinBlue region: alpha helix; purple color: random coil; red shade: extended strand; green area:beta turn.2.3 CaTPS9系统进化关系分析
通过NCBI数据库进行BlastP比对，获得与CaTPS9同源性较高的其他物种的蛋白序列，包括拟南芥（NP_173799.1）、烟草（XP_016478522.1）、马铃薯（XP_006340112.1）、番茄（XP_004237260.1）、蓖麻 Ricinus communis（XP_002521023.2）、大豆 Glycine max（XP_003519705.1）、甘蓝型油菜 Brassica napus （XP_013732635.2）、黄瓜 Cucumis sativus （XP_031741421.1）、葡萄（XP_002283215.1）、甜瓜 Cucumis melo （XP_008446229.1）、芜菁 Brassica rapa （XP_009110077.1）、玉米 Zea mays （XP_008664697.1）。系统进化分析表明，CaTPS9与同科物种烟草、番茄和马铃薯亲缘关系最近，与大豆亲缘关系较远（图6）。
2.4 CaTPS9基因启动子元件分析
CaTPS9启动子区域含有与激素、胁迫、植物生长发育相关的顺式作用元件（表2）。其中，激素响应元件包括脱落酸响应元件（ABRE）、生长素响应元件（AuxRR-core）、赤霉素响应元件（TATC-box）和水杨酸响应元件（TCA-element）。胁迫相关的顺式作用元件有干旱诱导元件（MBS）和厌氧诱导元件（ARE）。除此之外，还发现了参与玉米蛋白代谢调节元件（O2-site）、参与种子特异调控元件（RY-element）和参与分生组织表达相关的元件（CAT-box）。
表 2 CaTPS9启动子顺式作用元件预测分析Table 2. Putative cis−element analysis on promoter regions of CaTPS9分类
Classification元件名称
Element name序列
Sequence功能预测
Function prediction激素响应元件
Hormone response element脱落酸响应元件
ABREACGTG 参与响应脱落酸的顺式作用元件
cis-acting element involved in abscisic acid responsiveness生长素响应元件
AuxRR-coreGGTCCAT 参与响应生长素的顺式作用元件
cis-acting regulatory element involved in auxin responsiveness赤霉素响应元件
TATC-boxTATCCCA 参与响应赤霉素的顺式作用元件
cis-acting element involved in gibberellin-responsiveness水杨酸响应元件
TCA-elementCCATCTTTTT 参与响应水杨酸的顺式作用元件
cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness胁迫响应元件
Stress response element干旱诱导元件
MBSCAACTG 参与干旱诱导的MYB结合位点
MYB binding site involved in drought-inducibility厌氧诱导元件
AREAAACCA 参与厌氧诱导的顺式作用元件
cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction植物生长发育元件
Plant growth and development elements玉米蛋白代谢调节元件
O2-siteGATGA（C/T）
（A/G）TG（A/G）参与玉米蛋白代谢调节的顺式作用元件
cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation种子特异调控元件
RY-elementCATGCATG 参与种子特异调控的顺式作用元件
cis-acting regulatory element involved in seed-specific regulation分生组织表达相关元件
CAT-boxGCCACT 与分生组织表达相关的顺式作用元件
cis-acting regulatory element related to meristem expression2.5 CaTPS9基因在不同组织中的表达分析
qRT-PCR结果表明（图7），CaTPS9基因在辣椒不同组织中的表达存在显著差异。CaTPS9在叶片中的表达量最高，其次是成熟果胎座和幼果胎座，而在商品果胎座中的表达量最低，且CaTPS9在叶片中的表达量约为商品果胎座的30倍，CaTPS9在商品果果肉、幼果果肉、根和花中的表达量显著低于其他组织。这些结果进一步表明CaTPS9基因主要在辣椒的叶片中起作用。
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图 7 CaTPS9基因在辣椒不同组织的表达模式PECP：商品果果肉；YPE：幼果果肉；RPE：成熟果果肉；PLCP：商品果胎座；YPL：幼果胎座；RPL：成熟果胎座；L：叶；R：根；S：茎；F：花；不同小写字母表示CaTPS9基因表达量在辣椒不同组织间差异显著（P＜0.05）。图8同。Figure 7. Expressions of CaTPS9 in different tissues of pepper plantPECP: pericarp of commerical pepper; YPE: young pericarp; RPE: ripened pericarp; PLCP: placenta of commercial pepper; YPL: young placenta; RPL: ripened placenta ; L: leaf; R: root; S: stem; F: flower; those with different lowercase letters significantly different between different tissues of pepper at P＜0.05. Same for Fig. 8.2.6 CaTPS9基因在不同胁迫条件下的表达分析
在低温胁迫条件下，CaTPS9基因的表达量被显著抑制，在胁迫1 h和6 h后分别下降11.72%和18.22%，而在胁迫处理3 h后下降34.14%（图8A）。随着胁迫处理时间的增加，CTPS9基因的表达量逐渐降低，在72 h后表达量最低，较0 h降低74.59%。
在IAA处理下，CaTPS9基因的表达量呈现先下降后上升再下降的趋势。在处理3 h时CaTPS9基因的表达量较对照降低59.99%，在24 h的表达量达到峰值并高于对照处理6.34%（图8B）。在处理48 h和72 h CaTPS9基因的表达量显著降低，较对照分别降低56.57%和64.25%。
在ABA处理下，CaTPS9基因的表达量先显著下调，处理12 h后升高到峰值，但较对照处理下降16.65%（图8C）。处理24 h后CaTPS9基因的表达量最低，较对照处理降低73.83%。
在SA处理下，CaTPS9基因的表达量在处理3 h后与对照处理的表达量基本一致（图8D）。在处理12 h和48 h表达量显著高于对照处理，分别较对照处理增加31.33%和19.72%，而在处理1 h、6 h、24 h和72 h CaTPS9基因的表达量显著低于对照处理，分别下降76.15%、61.85%、66.38%和74.65%。
在GA3处理下，CaTPS9基因的表达量在处理1 h后显著降低，较对照处理降低了67.94%（图8E）。随后在处理3~12 h后CaTPS9基因的表达量逐渐上升，而处理72 h后达到峰值，高于对照处理3.51%。
在MeJA处理下，CaTPS9基因的表达量被显著抑制，在处理1 h、3 h、6 h和72 h分别较对照处理下降47.38%、62.88%、64.85%和74.76%（图8F）。在处理12 h、24 h和48 h后CaTPS9基因的表达量显著降低且几乎不表达。
3. 讨论与结论
海藻糖通过维持植物渗透压、生物膜结构和信号转导等响应植物对逆境胁迫的抗性[2]。TPS家族成员是海藻糖合成和代谢途径中的关键组成部分，在植物响应逆境胁迫中发挥重要作用，并已在多种物种中被鉴定[32-33]。本研究从辣椒叶片中克隆了CaTPS9基因，序列分析表明CaTPS9编码867个氨基酸，含有TPS家族保守结构域Glyco_transf_20和Trehalose_PPase，与大多数TPS的保守结构域结果一致[34-35]。通过对CaTPS9蛋白跨膜结构和磷酸化位点预测结果发现，CaTPS9蛋白不存在跨膜结构，含有76个丝氨酸磷酸化位点，推测CaTPS9蛋白主要通过丝氨酸进行磷酸化修饰，这与大豆GsTPS9的磷酸化预测结果基本一致[35]。亚细胞定位预测CaTPS9蛋白可能位于细胞质中，这与甘薯中IbTPS1蛋白的位置相同[33]。系统进化关系分析表明，辣椒CaTPS9基因与烟草、番茄和马铃薯的亲缘关系较近，这可能是由于辣椒、烟草、番茄和马铃薯都属于茄科植物。
基因在不同组织中的差异表达可以用于预测基因功能的多样性[36]。大豆GsTPS9基因在根中表达量最高[35]，木薯MeTPS9基因在须根中的表达量最高[34]，表明在大豆和木薯中TPS9基因主要在根中起作用。本研究通过分析辣椒不同组织中CaTPS9基因的表达量，发现CaTPS9在叶片中的表达量最高，这种差异可能是TPS基因在不同物种或不同组织中的表达不同，并且发挥着不同的作用。
植物的非生物胁迫通过调控基因的表达进而引起生理生化变化[37]。研究表明，植物中TPS基因可以抵御低温等非生物胁迫。水稻中过表达OsTPS1基因提高了水稻幼苗对低温胁迫的耐受性[9]，并且木薯MeTPS9基因在低温处理下的表达量显著增加[34]。而本研究中，CaTPS9基因的表达量在低温处理下被显著抑制，这可能与物种间的差异有关。此外，本试验分析了CaTPS9基因在IAA、ABA、SA、GA3和MeJA胁迫中的表达模式。IAA是植物生长发育的主要调节因子，主要通过生物合成和运输来调节植物的生长[38]。本研究发现CaTPS9基因的表达量在IAA处理下受到抑制，并且该基因的启动子区域包含生长素相关的顺式作用元件（AuxRR-core），表明CaTPS9可能参与IAA相关的基因调控，进而影响植物生长发育。ABA信号参与调控植物低温、干旱等非生物胁迫[39]。在拟南芥中，AtTPS5的表达与ABA诱导的非生物胁迫紧密相关，并且作为ABA信号转导的负调控因子发挥作用[7]。本研究发现CaTPS9基因的表达量在ABA处理下被显著抑制，CaTPS9启动子区域含有ABA相关的顺式作用元件（ABRE），表明CaTPS9可能参与ABA信号转导。SA是一种与免疫有关的植物激素，并且是诱导植物响应非生物逆境胁迫的抗逆信号分子[40]。大豆GsTPS9在SA处理下的表达量显著上调[35]，辣椒CaTPS9基因的表达量在SA处理12 h和48 h后显著上调，并且CaTPS9含有水杨酸相关的顺式作用元件（TCA-element），表明CaTPS9基因可能参与水杨酸胁迫的调控。在GA3处理下，马铃薯中大多数TPS基因的表达量显著下调[41]。本试验也发现CaTPS9基因在GA3处理下表达量显著降低，且CaTPS9基因启动子区域含有赤霉素相关的顺式作用元件（TATC-box），表明CaTPS9基因可能参与赤霉素激素胁迫调控。研究表明，海藻糖合成相关基因的表达水平在MeJA处理下上调[42] 。在MeJA处理下，西瓜ClTPS1基因的表达量呈现出先上升后下降的趋势[43]，而CaTPS9基因的表达量在MeJA处理下显著降低。以上结果表明，CaTPS基因可能通过海藻糖生物合成途径响应逆境胁迫。
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图 1 CaTPS9基因扩增产物
M：GL DNA Marker 5000，1～2：PCR产物。
Figure 1. Amplification products of CaTPS9
M: DNA marker 5000; 1-2: amplified cDNA product of CaTPS9.
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图 2 CaTPS9蛋白疏水性和亲水性预测
Figure 2. Predicted hydrophobicity and hydrophilicity of CaTPS9 protein
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图 4 CaTPS9蛋白的二级结构预测
蓝色区域表示α-螺旋；紫色区域表示无规则卷曲；红色区域表示延伸链；绿色区域表示β-转角。
Figure 4. Predicted secondary structure of CaTPS9 protein
Blue region: alpha helix; purple color: random coil; red shade: extended strand; green area:beta turn.
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图 7 CaTPS9基因在辣椒不同组织的表达模式
PECP：商品果果肉；YPE：幼果果肉；RPE：成熟果果肉；PLCP：商品果胎座；YPL：幼果胎座；RPL：成熟果胎座；L：叶；R：根；S：茎；F：花；不同小写字母表示CaTPS9基因表达量在辣椒不同组织间差异显著（P＜0.05）。图8同。
Figure 7. Expressions of CaTPS9 in different tissues of pepper plant
PECP: pericarp of commerical pepper; YPE: young pericarp; RPE: ripened pericarp; PLCP: placenta of commercial pepper; YPL: young placenta; RPL: ripened placenta ; L: leaf; R: root; S: stem; F: flower; those with different lowercase letters significantly different between different tissues of pepper at P＜0.05. Same for Fig. 8.
表 1 CaTPS9基因引物信息及功能
Table 1 Information and function of CaTPS9 primer
引物名称
Primer name引物序列
Primer sequence（5′-3′）用途
PurposeCaTPS9-F ATGGCATCAAGATCTAGTGCA 基因扩增
Gene amplificationCaTPS9-R TTACCCACTCAAATTAACAGATGAG qCaTPS9-F GCATTGGAGATGACAGGTCGGATG 荧光定量PCR
qRT-PCRqCaTPS9-R ACTTGGCTTTGCTTGGCTTTTGC qActin-F AGAGATTCCGTTGCCCAGAGGTC 内参基因
Reference geneqActin-R AGCCACCACTGAGCACAATGTTAC 
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表 2 CaTPS9启动子顺式作用元件预测分析
Table 2 Putative cis−element analysis on promoter regions of CaTPS9
分类
Classification元件名称
Element name序列
Sequence功能预测
Function prediction激素响应元件
Hormone response element脱落酸响应元件
ABREACGTG 参与响应脱落酸的顺式作用元件
cis-acting element involved in abscisic acid responsiveness生长素响应元件
AuxRR-coreGGTCCAT 参与响应生长素的顺式作用元件
cis-acting regulatory element involved in auxin responsiveness赤霉素响应元件
TATC-boxTATCCCA 参与响应赤霉素的顺式作用元件
cis-acting element involved in gibberellin-responsiveness水杨酸响应元件
TCA-elementCCATCTTTTT 参与响应水杨酸的顺式作用元件
cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness胁迫响应元件
Stress response element干旱诱导元件
MBSCAACTG 参与干旱诱导的MYB结合位点
MYB binding site involved in drought-inducibility厌氧诱导元件
AREAAACCA 参与厌氧诱导的顺式作用元件
cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction植物生长发育元件
Plant growth and development elements玉米蛋白代谢调节元件
O2-siteGATGA（C/T）
（A/G）TG（A/G）参与玉米蛋白代谢调节的顺式作用元件
cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation种子特异调控元件
RY-elementCATGCATG 参与种子特异调控的顺式作用元件
cis-acting regulatory element involved in seed-specific regulation分生组织表达相关元件
CAT-boxGCCACT 与分生组织表达相关的顺式作用元件
cis-acting regulatory element related to meristem expression
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