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不同水稻tms5突变位点对雄性不育起点温度的影响

吴明基, 刘华清, 陈建民, 付艳萍, 杨绍华, 宋亚娜, 林艳, 王锋

吴明基，刘华清，陈建民，等. 不同水稻tms5突变位点对雄性不育起点温度的影响 [J]. 福建农业学报，2023，38（7）：761−771. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.07.001
引用本文: 吴明基，刘华清，陈建民，等. 不同水稻tms5突变位点对雄性不育起点温度的影响 [J]. 福建农业学报，2023，38（7）：761−771. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.07.001
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WU M J, LIU H Q, CHEN J M, et al. Critical Sterility-inducing Temperature of Rice Affected by tms5 Mutation Site [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences，2023，38（7）：761−771. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.07.001
Citation: WU M J, LIU H Q, CHEN J M, et al. Critical Sterility-inducing Temperature of Rice Affected by tms5 Mutation Site [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences，2023，38（7）：761−771. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.07.001
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不同水稻tms5突变位点对雄性不育起点温度的影响

  • 福建省农业科学院生物技术研究所/福建省农业遗传工程重点实验室，福建　福州　350003

基金项目: 福建省自然科学基金项目（2020J011359）；福建省农业高质量发展超越“5511”协同创新工程项目（XTCXGC2021002）；福建省科技重大专项（2020NZ08017）
详细信息
    作者简介:

    吴明基（1976 —），男，博士，助理研究员，主要从事水稻遗传育种研究，E-mail：839845032@qq.com

    通讯作者:

    王锋（1963 —），男，博士，研究员，主要从事水稻基因工程与遗传育种研究，E-mail：wf@fjage.org

  • 中图分类号: S511

Critical Sterility-inducing Temperature of Rice Affected by tms5 Mutation Site

  • Institute of Biotechnology, Fujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Key Laboratory of Agricultural Genetic Engineering, Fuzhou, Fujian 350003, China

摘要

    摘要
  • 摘要:
      目的  研究不同水稻tms5突变位点对雄性不育起点温度的影响，探讨不育起点温度遗传调控途径。
      方法  在水稻TMS5的6个外显子上设计11个CRISPR/Cas9基因编辑靶点，依次命名为T501 — T511，构建相应载体转化粳稻品种日本晴和籼稻品种明恢86，获得各靶点的tms5移码突变体。田间自然高温及人工气候箱（设日平均22 、24和28 ℃ 3种温度）条件下分析tms5突变体的花粉碘染及自交结实率，鉴定不育起点温度。
      结果  粳稻日本晴tms5突变体的不育起点温度高于28 ℃，籼稻明恢86的不同tms5突变体不育起点温度为22～28 ℃。此外，同一遗传背景下，通过T501靶点编辑产生的tms5-1移码突变体不育起点温度均显著高于T502靶点的tm5-2突变体，其他位点上的tms5突变体育性特征与tm5-2突变体并无差异。基因表达量分析表明，tms5-1突变体幼穗UbL40 基因表达量显著低于tm5-2突变体的表达量。
      结论  水稻tms5突变体不育起点温度不仅受遗传背景的影响，tms5基因突变位点不同也会影响不育起点温度，特别是T501位点与其余位点突变体间不育起点温度差异显著，为研究水稻tms5两系不育起点温度的分子机理及遗传调控网络提供了新思路。
    Abstract:
      Objective   Effects of tms5 mutation site and related genetic regulatory factors in rice on the critical sterility-inducing temperature (CSIT) of the plant were investigated.
      Method  Eleven CRISPR/Cas9 sequentially numbered T501 through T511 were designed to target 6 exons of tms5 to create mutants of Nipponbare (NIP, Oryza sativa ssp. Geng) and Minghui 86 (MH86, O. sativa ssp. Xian). Pollen male fertility and seed setting rate of the mutants were monitored under long day and high temperature field conditions in early August in Fuzhou (NHT) or at 22, 24, and 28 ℃ in phytotrons to identify the CSIT.
      Result   The CSIT of the NIP mutants were higher than 28 ℃, while that of the MH86 mutants between 22 ℃ and 28°C. The tms5-1 T501 mutant had a significantly higher CSIT than the genetically identical tms5-2 counterparts T502, but the other 9 tm5 and the tm5-2 mutants did not differ on it. Expressions of the 3 UbL40 in young panicles were lower in the tms5-1 than the tm5-2 mutants of either rice varieties.
      Conclusion   It appeared that the CSIT of tms5 mutants was affected by the genetic factors as well as the mutation site as the tms5-1 mutant T501 was shown significantly differed from the others.
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  • 0.   引言

    【研究意义】当前水稻生产上利用的光温敏雄性核不育系（两系不育系）具有长日高温不育、短日低温可育的特点，但育性表达不稳定，不育起点温度存在“遗传漂变”现象[1-5]，目前对于不育起点温度的遗传解析进展缓慢，因此创制并利用新型材料对不育起点温度进行研究具有重要意义。【前人研究进展】前人研究表明，在不同遗传背景下，由同一个核不育基因控制的两系不育系可表现出显著的不育起点温度差异[3-5]；另一方面，同一遗传背景下，不同世代间及同一世代不同单株间的不育系材料也会表现出不育起点温度的遗传漂变现象[3-5]。近年来，研究者已经成功克隆了Photoperiod-sensitive Male Sterility-1（PMS1）[6]、Photoperiod-sensitive Male Sterility-3（PMS3）[7-8]、Thermosensitive Male Sterility-5(TMS5） [9]、Thermosensitive Male Sterility-10（TMS10） [10]、Carbon Starved Anther（CSA） [11]和Male Sterile1（MS1） [12-13]等多个决定水稻光/温敏核不育性状的基因，可以更加深入了解光温条件控制水稻育性转换的分子机制。其中，tms5（LOC_Os02g12290）基因在当前两系杂交稻生产上应用最为广泛[9,14]，TMS5通过调控UbL40基因在花粉母细胞中的表达量控制水稻花粉发育。在高温条件下，水稻tms5突变体UbL40 mRNA表达量增高，可导致水稻花粉败育，但低温条件下，UbL40 mRNA表达量较低，并不影响花粉正常发育，这一机制决定了tms5水稻高温不育和低温可育的育性转换温敏特性[9]。Tan等[14]发现TMS5基因的cds.71是一个突变热点，在绝大部分已育成的两系不育系中，温敏雄性不育性都由TMS5第71位碱基从C到A的单一突变基因型决定[2,9]。前人研究认为，不同tms5不育系间的雄性不育起点温度差异，由不同遗传背景决定，与tms5突变基因本身无关[15,16]。Zhou等[15]利用CRISPR/Cas9对11个水稻品种的TMS5位点进行编辑，所获得的tms5不育系中，大多数不育系的不育起点温度符合水稻两系不育系育种的生产实际要求（23～24 ℃），但少数材料不育起点温度较高，不能适应生产实际需求。Barman[17] 、吴明基[18]、陈日荣[16]、黄忠明[19]、杜茜[20]、Fang[21] 和梁敏敏[22]等也利用CRISPR/Cas9对多个籼稻或粳稻品种TMS5位点进行编辑，发现粳稻背景的tms5突变体育性起点温度显著高于籼稻背景的tms5突变体，此外，不同籼稻tms5突变体间的不育起点温度也并不相同。【本研究切入点】从目前已有的有关水稻tms5突变体的研究看，不同的研究者均观察到tms5突变体不育起点温度受不同遗传背景的影响，但对其具体的作用机制尚缺少深入了解。【拟解决的关键问题】本研究构建11个CRISPR/Cas9-TMS5基因编辑载体，靶向水稻TMS5基因不同位置，利用这些载体转化粳稻品种日本晴和籼稻品种明恢86，获得各靶点上的tms5移码突变体，分析这些突变体的育性转换特征，以期为水稻tms5不育起点温度分子调控机制的研究提供新材料与新思路。

    1.   材料与方法

    1.1   试验材料

    水稻材料为籼稻品种明恢86与粳稻品种日本晴。试验所用引物的合成及PCR产物测序均由铂尚生物技术（福州）有限公司完成，其他试剂为实验室通用试剂。

    1.2   试验方法

    1.2.1   载体构建及遗传转化

    水稻温敏核不育基因TMS5共有6个外显子，利用http://www.e-crispr.org/生物信息学网站设计CRISPR/Cas9靶点，在TMS5第一外显子处设计了5个靶点，第二外显子处设计了2个靶点，其余4个外显子处各设计了1个靶点，各靶点依次命名为T501 — T511，总共合成11对sgRNA靶序列（表1）。利用北京唯尚立德生物技术公司提供的VK005-1载体快速构建试剂盒，共构建11个CRISPR/Cas9-TMS5基因编辑载体，依次命名为TMS501 — TMS511，将这些基因编辑载体转化到根癌农杆菌LBA4404中，利用农杆菌介导的方法转化日本晴与明恢86，通过筛选鉴定，获得相应载体的转基因水稻，具体步骤参照苏军等[23]的方法。

    表  1  本试验所用sgRNA序列
    Table  1.  sgRNA applied
    靶位点
    Target    		序列（5′- 3′）
    Sequence    		试验目的
    Purpose
    T501S CAGGAACAGCGGCAAGTCATCGC sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T501A AACGCGATGACTTGCCGCTGTTC
    T502S CAGCCACCGCGCCGCCACCGGGT sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T502A AACACCCGGTGGCGGCGCGGTGG
    T503S CAGCACCGTCGAGGGCTACCCCG sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T503A AACCGGGGTAGCCCTCGACGGTG
    T504S CAGCCCATGTACGTCGCCACCCG sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T504A AACCGGGTGGCGACGTACATGGG
    T505S CAGAACCTCGTCCCCCTCGAGAT sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T505A AACATCTCGAGGGGGACGAGGTT
    T506S CAGGTAGGGGTATGTGATATACA sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T506A AACTGTATATCACATACCCCTAC
    T507S CAGATCAAGCAGCTGAAGCTGTC sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T507A AACGACAGCTTCAGCTGCTTGAT
    T508S CAGTGCTTTTACCGGAGATACGA sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T508A AACTCGTATCTCCGGTAAAAGCA
    T509S CAGTGGGCACACCCATCTGTTTG sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T509A AACCAAACAGATGGGTGTGCCCA
    T510S CAGTTCTGCTCGTTATACCGCAG sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T510A AACCTGCGGTATAACGAGCAGAA
    T511S CAGAAGTAGAGTTCATGCATTGA sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T511A AACTCAATGCATGAACTCTACTT
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    1.2.2   基因型鉴定

    使用CTAB法[24]从T0、T1和T2世代各单株的水稻叶片中提取基因组DNA，通过PCR扩增潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）鉴定转基因阳性植株。设计并合成引物TMS5F与TMS5R(表2)，通过PCR扩增出T0、T1和T2代各植株的TMS5基因组片段。具体鉴定步骤参照吴明基等[18]的方法。获得的PCR产物由铂尚生物技术（福州）有限公司进行Sanger测序，鉴定各靶点tms5突变情况，通过T0代自交分离，于T1代筛选出两条染色体上突变类型相同的纯合移码突变体单株，用于花粉育性鉴定。

    表  2  供试引物
    Table  2.  Primers selected
    引物名
    Primer name    		序列
    Sequence (5′-3′)    		试验目的
    Purpose
    HptFAGGTCAGGCTCTCGCTAAAC转基因阳性株检测/
    Identify transgenic plants
    Hpt-RACGTAAGGGATGACGCACAAT
    TMS5FCCATCGTGCTTCGTGCCATMS5基因扩增、测序
    PCR and Sanger sequence for TMS5
    TMS5RGAGTTCTTGGTACATGAGTGC
    UBL401FCTACCCCAAGGGGATCGAGReal-Time PCR
    UBL401RGCAAGGCGGTCGATTGAACT
    UBL402FTCGCTCAGGGTCCTCGCCTAReal-Time PCR
    UBL402RCTAGATTCGGCATCCAGTAG
    UBL404FTACACCATCCAGGAGCCCAReal-Time PCR
    UBL404RGGTAGCTGGGCATACGAAG
    ActinFCGTCTGCGATAATGGAACTGReal-Time PCR
    ActinRTCTGGGTCATCTTCTCACGA
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    1.2.3   材料种植管理与光温处理

    2017 — 2019年，在福州寿山试验基地（北纬26°08′，东经119°28′，海拔400 m）种植明恢86、日本晴及这两个品种的tms5突变体。2017年于温室种植T0代。2018年种植T1代，在明恢86和日本晴背景下，每一个靶点的tms5突变体各选择3个来源于独立克隆的T1代株系进行大田种植。因明恢86背景的材料生育期较长，于5月20日播种，日本晴来源的生育期较短，于6月20日播种。秧苗25 d秧龄时移栽到大田，单本种植，每份材料各种100株。2019年种植T2代材料，播种时间与2018年相同。两个背景下选择T501和T502靶点突变体材料各3个克隆进行盆栽及大田种植，其中盆栽材料每份15盆，每盆1株，用于人工气候箱育性鉴定。大田或盆栽材料均采取正常田间水肥管理与病虫害防治。T0和T1代不育株进行割兜再生，在幼穗分化敏感期利用寿山基地秋季自然低温或人工气候箱日均22 ℃低温处理，抽穗后移到温室套袋收种。得到的tms5纯合突变株用于后续的花粉育性观察与鉴定。

    1.2.4   花粉育性鉴定

    （1） 田间自然条件育性鉴定

    福州8月中旬田间环境下，当tms5突变体及野生型亲本抽穗时，采集即将开花小穗的上、中、下各2朵颖花制片，用1%的I2-KI对花粉进行染色，通过显微镜观察，统计花粉黑染率。套袋10株，25 d后随机选择10穗调查自交结实率。

    （2） 人工气候箱育性鉴定

    当盆栽tms5突变体稻株及野生型亲本主茎处于幼穗分化第四期时，将盆栽植株移入人工气候箱（加拿大Conviron公司）进行不同温度处理，同一温度条件下，每份材料处理5盆。不同温度处理设置为日平均22 ℃、24 ℃和28 ℃ 3种温度条件，光照时长均为14.5 h，具体光温处理条件设置参照吴明基等[18]的方法。处理7 d后，将供试材料移出人工气候箱，用记号笔标记叶枕距约±1 cm的稻穗，待抽穗后调查花粉黑染率，并将调查的稻穗套袋，种子成熟后计算结实率，得到的花粉黑染率及结实率数据经反正弦平方根转换后作方差分析。

    1.2.5   UbL40表达量检测

    明恢86及日本晴来源的T501和T502靶点突变体材料经人工气候箱24 ℃和28 ℃处理结束7 d后，快速剥取3~5个处于花粉母细胞形成期到花粉母细胞减数分裂期的幼穗（长约3 cm），迅速放入液氮罐内储存，每份材料各取样3个重复。提取每份样品的RNA，用2 μg总RNA作模板，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒（Thermo Scientific，UC，Lithuania）合成cDNA。以合成的cDNA作模板，在QuantStudio3实时荧光定量PCR系统（ThermoFisher Scientific，Singapore）上用ChamQTM SYBR qPCR Master Mix（Vazyme Biotech，Nanjing，China）进行实时定量RT-PCR，以水稻Actin为内参，通过2−ΔΔCT[9]计算UbL401、UbL402和UbL404基因的相对表达水平。所有试验进行3次技术重复。用于基因表达量分析的不同引物名称及序列列于表2。

    2.   结果与分析

    2.1   不同TMS5基因编辑载体的靶向突变效率分析

    构建11个CRISPR/Cas9-TMS5基因编辑载体TMS501-TMS511，通过农杆菌介导方法将这11个载体转入明恢86与日本晴的愈伤组织，获得各载体转化的T0代水稻幼苗，经PCR检测潮霉素抗性基因，获得阳性转基因植株（表3）。利用特异性引物（表2）扩增11个TMS5靶点的目的序列并进行测序。测序结果分析发现，明恢86和日本晴遗传背景的所有11个靶点转基因T0代，都在靶点位置发生了碱基的插入或缺失突变（表3、图1）。其中，TMS508和TMS510载体诱导的突变效率较低，仅有10%～13.3%；而TMS501、TMS502、TMS506、TMS509和TMS511等5个载体诱导的突变率均高于65%，可以作为TMS5的候选基因编辑靶点，进行水稻两系不育系定向创制。收获T0代种子，T1代继续进行突变位点鉴定，得到的tms5纯合突变株用于后续的花粉育性观察与鉴定。

    表  3  各载体转化T0代植株突变分析
    Table  3.  Mutation of T0 transgenic plants
    载体
    Construct    		靶点位置
    Target site    		品种
    Variety    		转基因植株数
    Numbers of transgenic plants    		含突变植株数
    Numbers of mutation plants    		突变率
    Mutation rates/%
    TMS501 TMS5第一外显子
    First exon of TMS5    		 Nipponbare 21 15 71.4
    MH86 18 16 88.9
    TMS502 Nipponbare 22 21 95.5
    MH86 11 11 100.0
    TMS503 Nipponbare 29 11 37.9
    MH86 9 6 33.3
    TMS504 Nipponbare 21 11 52.4
    MH86 15 7 46.7
    TMS505 Nipponbare 21 6 28.6
    MH86 21 7 33.3
    TMS506 TMS5第二外显子
    2nd exon of TMS5    		 Nipponbare 19 13 68.4
    MH86 24 21 87.5
    TMS507 Nipponbare 10 2 20.0
    MH86 11 1 9.1
    TMS508 TMS5第三外显子
    3rd exon of TMS5    		 Nipponbare 10 1 10.0
    MH86 18 2 11.1
    TMS509 TMS5第四外显子
    4th exon of TMS5    		 Nipponbare 21 14 66.6
    MH86 18 13 72.2
    TMS510 TMS5第五外显子
    5th exon of TMS5    		 Nipponbare 10 1 10.0
    MH86 15 2 13.3
    TMS511 TMS5第六外显子
    6th exon of TMS5    		 Nipponbare 14 12 85.7
    MH86 11 9 81.8
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    图  1  CRISPR/Cas9系统介导的TMS5基因特异性突变
    A：TMS5基因结构的示意图，黑色矩形代表TMS5的6个外显子，图中短竖线所指位置为各靶点在TMS5基因上的位置。B：CRISPR/Cas9介导的TMS5突变实例，每个靶点只列出了一种突变类型， T505、T508、T510靶点列出的是杂合型突变，T511靶点是双突变，其余位点列出的均为纯合型突变；图上三角形处为缺失或插入突变发生的位置。
    Figure  1.  CRISPR/Cas9-mediated genome editing of tms5
    A.Schematic tms5 structure; black rectangles represent 6 exons of tms5; short vertical line refers to position of each target. B. CRISPR/Cas9-mediated tms5 mutants; only one mutation type is listed for each target; T505, T508, and T510 are listed as heterozygous mutations; T511 as biallelic mutation; and remainders as homozygous mutations; triangles point at deletion and insertion sites.
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    2.2   tms5突变体田间育性鉴定

    所有T1代材料于8月15 — 20日开始抽穗，观察鉴定所有突变体的花粉育性特征（图2）。T501与T502靶点产生的突变体以下分别简称为tms5-1突变体与tms5-2突变体。日本晴遗传背景的tms5-1突变体（依据不同纯合突变基因型，分别命名为N-T501-#1, -#2, -#3，各纯合移码突变基因型列于表4，均表现花药较黄且肥大，多数花药能够正常开裂并散粉，镜检可见大量黑染花粉。而日本晴tms5-2突变体（依据不同纯合突变基因型，分别命名为N-T502-#1,-#2, -#3）及其他9个靶点的突变体均表现出不同程度的育性分离，在不同稻穗间及同一稻穗上可同时观察到可育和不育特征的颖花，育性极不稳定。来源于明恢86遗传背景的tms5-1突变体（依据不同纯合突变基因型，分别命名为M-T501-#1, -#2, -#3）育性也表现出穗上和穗间分离特征，类似于日本晴tms5-2突变体。而来源于明恢86其他靶点的tms5突变体则彻底不育，镜检结果为无花粉型（图2）。

    图  2  T1代tms5突变体在田间高温下的花粉育性
    ①A和B：明恢86（A）及日本晴（B）遗传背景的tms5突变体T1代材料花粉育性；两种背景的tms5突变体（依次为T501至T511靶点突变）育性敏感期处于福州8月初的自然长日高温条件；MH86为明恢86，NIP为日本晴；M-#和N-#分别代表明恢86和日本晴遗传背景的突变体。C：明恢86和日本晴两种遗传背景的野生型、tms5-1突变体及tms5-2突变体穗部开花特征。D： M-T501-#1同一穗上出现可育与不育的颖花。②标尺长度：80 µm（A、B）， 0.5 cm（C、D）。
    Figure  2.  Pollen fertility of T1 tms5 mutants under NHT
    ①Aand B: Pollen fertility of tms5 mutants in MH86 (A) and NIP (B) induced at 11 targets from T501 to T511; NHT was in early August in Fuzhou; M-# and N-# are mutant plants of MH86 and NIP, respectively. C: Flowering characteristics of WT, tms5-1, and tms5-2 mutants of NIP and MH86 backgrounds. D: Both fertile and sterile spikelets were set on same panicle of M-T501-#1. ②Scale bars represent 80 μm for A and B, 0.5 cm for C and D.
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    表  4  T1代tms5材料结实率
    Table  4.  Seed setting rates of T1 generation of tms5 mutants
    背景
    Background    		材料
    Lines    		突变序列
    § Mutation sequences    		平均结实率
    †Average seed setting rates/%
    明恢86
    MH86    		MH8687.5±4.3 a
    M-T501-#1T501gaacagcggcaagtcatAcgccgg6.9±9.6 b
    M-T501-#2T501gaacagcggcaagtcatTcgccgg4.0±5.6 b
    M-T501-#3T501gaacagcggcaagtcatCcgccgg5.4±6.9 b
    M-T502-#1T502ccaccgcgcc-------ggtc0 c
    M-T502-#2T502ccaccgcgccgccaccgCggtcgg0 c
    M-T502-#3T502ccaccgcgccgccaccgTggtcgg0 c
    M-T511-#1T511gtagagttcatgcat-gaaggaa0 c
    M-T511-#2T511gtagagttcatgcatTtgaaggaa0 c
    M-T511-#3T511gtagagttcatgcatAtgaaggaa0 c
    Nipponbare89.5±2.0 a
    日本晴
    Nipponbare    		N-T501-#1T501gc-----------------gacc48.9±22.1 c
    N-T501-#2T501gaacagcggcaagtca--gccgg54.2±15.8 b
    N-T501-#3T501gaacagcggcaagtcatTcgccgg44.1±12.2 c
    N-T502-#1T502ccaccgcgccg------Cggtcggc10.1±10.2 d
    N-T502-#2T502ccaccgcgccgccaccgAggtcggc8.8±10.1 d
    N-T502-#3T502ccaccgcgccgccaccgTggtcgg9.4±9.6 d
    N-T511-#1T511gtagagttcatgca--gaaggaa9.6±8.4 d
    N-T511-#2T511gtagagttcatgcatCtgaaggaa10.6±10.0 d
    N-T511-#3T511gtagagttcatgcatAtgaaggaa10.4±8.9 d
    ①§靶点位置的大写字母和短划线分别表示插入与缺失突变类型。 ②†结实率为10穗结实率的平均值±标准差。③同列数据后不同小写字母表示依据LSD多重比较，同一遗传背景材料间的差异达显著水平（P＜0.05），下同。
    ①§ Capital letters and dashes at target sites indicate type of insertion and deletion mutations, respectively. ②† Average seed setting rates are mean ± standard deviation calculated from 10 panicles. ③ Data with different lowercase letters on same column indicate significant difference according to LSD multiple comparison (P＜0.05), Same for below.
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    将每个突变体套袋，种子成熟后随机统计10穗的结实率列于表4。因同一背景下T502 — T511各靶点产生移码突变体的育性特征相似（图2），所以只采用T502与T511靶点突变体的结实率数据进行统计分析。从表4可知，野生型明恢86和日本晴结实率分别为87.5%与89.5%，自交结实率基本正常，所有tms5突变体的结实率都低于野生型亲本，其中，日本晴tms5-1突变体结实率为44.1%～54.2%，未发现完全不结实的稻穗。而其他靶点的日本晴tms5突变体出现完全不结实与部分结实稻穗共存的现象。由于不同稻穗的结实率差异明显，导致结实率方差分析结果出现标准差大于平均数的情况（表4）。明恢86遗传背景的tms5-1突变体植株也存在部分结实与完全不育的稻穗，与日本晴背景下的T502-T511靶位点的突变体表现相似，明恢86背景T502-T511靶点突变体的套袋稻穗则完全不结实（表4）。

    综上所述，在福州寿山试验基地8月中旬田间自然条件下，日本晴遗传背景的tms5突变体存在较高比例的花粉黑染及自交结实率，不能完全转为雄性不育系，但T501靶位点突变体与T502等其他靶位点突变体的育性有所不同，T501靶位点突变体的花粉黑染及自交结实率较T502等其他靶位点突变体的高。来源于明恢86遗传背景的tms5-1突变体表现部分不育，但在相同环境条件下，T502等其他10个靶点的tms5突变体则表现完全不育。这一结果表明，日本晴与明恢86两种不同遗传背景的tms5突变体的育性表现并不相同，其中日本晴tms5突变体的花粉败育程度低于明恢86tms5突变体。此外，日本晴与明恢86两个遗传背景的tms5-1突变体花粉育性及结实率都高于其他靶点产生的突变体。日本晴和明恢86两种背景下的tms5花粉败育程度的不同，可能是tms5突变体不育起点温度不同引起的，这与相关文献报道[16-20]的一致。但在两种遗传背景下，T501靶位点突变体的花粉黑染及自交结实率与T502等其他靶位点突变体的不同，这一现象尚未见报道，是否也与tms5突变体不育起点温度有关，尚待进一步利用人工气候箱进行分析。

    2.3   tms5突变体人工气候箱育性鉴定

    2019年8月，福州寿山田间自然条件下，T2代材料的育性表现与T1代类似，日本晴与明恢86两种遗传背景的tms5-1突变体花粉可育性都高于tms5-2突变体（表5，图3）。利用人工气候箱22 、24 和28 ℃进行育性鉴定结果表明，随着处理温度升高，tms5突变体的可育花粉数量减少，结实率降低（表5、图3）。其中，明恢86的tms5-2突变体只在22 ℃条件下出现黑染花粉，黑染率为9.3%～13.9%，结实率为1.5%～1.9%，在其他条件下都表现完全不育，说明了明恢86的tms5-2突变体不育起点温度约为22 ℃。然而，明恢86的tms5-1突变体在24 ℃处理后仍有大量可育花粉，自交结实率为30.7%～41.4%，不育起点温度高于24 ℃，这类材料在28 ℃条件下才表现完全不育。日本晴的两类tms5突变体育性表现也有类似规律，但tms5-1突变体在28 ℃条件下仍然表现较高的花粉黑染率（35.1%～40.1%）与自交结实率（13.1%～18.6%），并未出现完全不育。这一结果表明水稻tms5不育系的不育起点温度除了受到不同遗传背景调控影响外，T501位点的特异序列变异也与tms5不育系的起点温度有关。

    表  5  T2代tms5 突变体花粉育性及自交结实率
    Table  5.  Pollen fertility and seed setting rates of T2 tms5 mutants
    植株编号
    Plant ID    		花粉黑染率
    Stained pollens rate/%    		 自交结实率
    Seed setting rate/%
    22 ℃24 ℃28 ℃自然条件
    Natural condition    		 22 ℃24 ℃28 ℃自然条件
    Natural condition
    MH86 86.7±7.8 a 87.1±6.9 a 87.2±5.8 a 88.3±7.1 a 83.4±8.7 a 83.1±6.4 a 85.2±7.2 a 85.9±6.5 a
    M-T501-#1 87.5±10.3 a 61.6±13.5 c 0 b 20.5±11.5 c 67.8±20.3 b 30.7±12.3 c 0 b 8.5±10.6 c
    M-T501-#2 80.1±12.0 b 62.7±10.4 c 0 b 28.2±16.3 b 65.3±16.5 bc 40.2±20.5 b 0 b 21.3±16.3 b
    M-T501-#3 83.3±8.7 ab 71.2±20.2 b 0 b 25.6±15.6 bc 62.2±8.5 c 41.4±17.4 b 0 b 18.7±21.5 b
    M-T502-#1 12.1±10.6cd 0 d 0 b 0 d 1.5±0.3 d 0 d 0 b 0 d
    M-T502-#2 9.3±5.8d 0 d 0 b 0 d 1.8±0.6 d 0 d 0 b 0 d
    M-T502-#3 13.9±10.1 c 0 d 0 b 0 d 1.9±1.3 d 0 d 0 b 0 d
    Nipponbare 92.5±5.9a 90.6±7.3 a 91.1±6.3 a 92.5±6.5 a 87.6±8.2 a 88.1±9.3 a 87.8±6.6 a 90.5±2.3 a
    N-T501-#1 84.2±5.7 b 78.2±20.4 b 35.1±11.3 c 67.4±6.9 c 84.1±8.3 a 66.4±10.6 b 13.1±7.2 c 45.2±33.1 c
    N-T501-#2 86.2±19.5 b 80.2±12.9 b 37.1±8.8 bc 75.7±15.2 b 83.2±7.8 a 68.5±10.3 b 14.8±5.1 bc 52.1±35.8b
    N-T501-#3 82.3±21.2 b 80.1±18.1 b 40.1±10.5 b 69.1±9.6 c 83.1±10.9 a 50.5±12.2 c 18.6±9.5 b 50.7±28.3 bc
    N-T502-#1 82.2±6.8 b 70.0±20.2 c 6.1±2.5 d 25.2±19.0 e 72.3±9.2 bc 35.3±28.1 d 3.5±1.6 c 14.1±11.2 d
    N-T502-#2 85.5±6.3 b 72.2±18.5 c 7.6±6.6 d 31.1±16.9d 75.8±12.3 b 33.4±16.9 d 7.5±8.1 c 18.6±10.3 d
    N-T502-#3 84.1±9.2 b 70.5±16.7 c 9.2±8.1 d 26.3±27.7 e 69.6±9.2 c 25.4±20.3 e 4.2±2.5 c 17.6±16.3 d
    花粉黑染率及自交结实率均为5株的平均值，自然条件指福州8月份的长日高温条件。
    Data are means on 5 plants; NHT was defined as long day and high temperature in August in Fuzhou.
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    图  3  T2代tms5突变体在不同温度条件下的花粉育性
    ① 22℃ 、24 ℃、28 ℃、NHT分别表示明恢86及日本晴遗传背景的tms5-1及tms5-2突变体在人工气候箱22 ℃、24 ℃、28 ℃及福州8月初自然高温条件下(NHT)的花粉育性。MH86为明恢86，NIP为日本晴，M-#和N-#分别代表明恢86和日本晴遗传背景的突变体。②标尺长度：80 µm。
    Figure  3.  Pollen fertility of T2 tms5 mutants under varied temperatures
    ① Pollen fertility of tms5-1 and tms5-2 mutants of MH86 and NIP backgrounds cultivated at 22 ℃, 24 ℃ or 28 ℃ in phytotrons, or under NHT, respectively; M-# and N-# represent mutant plants of MH86 and NIP backgrounds, respectively. ② Scale bars are 80 μm in length.
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    2.4   UbL40基因的差异表达分析

    通过Real-Time PCR检测了明恢86和日本晴背景的野生型、tms5-1突变体和tm5-2突变体各材料幼穗中UbL401、UbL402和UbL404的表达水平（图4）。结果显示，明恢86和日本晴两种遗传背景的 tms5突变体中每个UbL40基因的表达量在28 ℃条件下均显著高于24 ℃条件下的表达水平，说明UbL40基因表达受温度调控，表达量可随环境温度的增高而增加，这些结果与前人的报道[9,22]一致。此外，相同温度条件下，tms5-1突变体中UbL40的mRNA表达量均显著低于tm5-2突变体的表达量，尤其在28 ℃条件下，UbL40基因在tm5-2突变体的表达量为最高水平，在tms5-1突变体的表达量为中等水平，在野生型对照的表达量最低（图4）。由于水稻tms5突变体UbL40 mRNA表达量增高，可导致水稻花粉败育[9]，因此tms5-1突变体与tm5-2突变体间不同的UbL40表达水平可能导致两类突变体在相同温度条件下表现出不同的育性特征。

    图  4  Ub L40基因的表达量差异分析
    A、B和C分别表示明恢86及日本晴tms5突变体UbL401、UbL402和UbL404的表达特征，数据为平均数±标准差，n=3。
    Figure  4.  Differential expressions of UbL40
    A, B and C: expressions of UbL401, UbL402, and UbL404 in tms5 mutants of MH86 and NIP, respectively. Data are mean ± standard deviation calculated from 3 replicates.
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    3.   讨论

    两系杂交稻育种过程中，选育出低不育起点温度的两系不育系对于生产合格的杂交稻种子至关重要，而当前生产上应用的tms5不育系表现出并不完全相同的不育起点温度，其遗传调控机制较为复杂 [2-5]。前人研究认为，多个微效基因间的互作决定了光温敏核不育水稻的不育起点温度，而遗传基础不纯可能是不育起点温度“遗传漂变”的内在原因[3-5,25-26]。近年来，国内多个研究团队[15-22]利用CRISPR/Cas9技术对多个籼稻与粳稻品种进行TMS5位点编辑，获得的大多数籼型不育系起点温度低于24 ℃，符合两系不育系育种的实际需求，但所有粳型不育系起点温度高于26 ℃，有些材料甚至要在32 ℃条件下才能完全不育，这种育性特征不能适应两系稻育种的实际生产需求。以上结果说明不同的tms5不育系材料因遗传背景的差异可表现出显著不同的温敏不育起点温度，粳稻材料不育起点温度过高，不能适应生产需求。周海、陈日荣、黄忠明等[15-16,19]认为，不同tms5不育系的雄性不育起点温度由不同水稻品种的遗传背景决定，与tms5突变基因本身无关。

    本研究通过对一系列tms5突变体不育起点温度的分析发现，相同靶位点的tms5突变体，粳稻背景下的tms5突变体不育起点温度较籼稻的高，这与前人报道[15-22]的一致。但本研究同时发现，在同一遗传背景下，不同靶位点突变体的不育起点温度也有所不同。无论在粳稻日本晴，还是在籼稻明恢86背景下，T501靶位点突变体（tms5-1）的不育起点温度显著高于T502等其他靶位点上产生的突变体的不育起点温度，这一新现象目前尚未见报道。进一步表达分析发现，在明恢86及日本晴背景下，3种UbL40的mRNA都是在较低不育起点温度的tm5-2突变体中表达量较高，在较高不育起点温度的tms5-1突变体的表达量较低，这一结果与目前对不育起点温度差异的解释相符[9, 22]。

    通过比较T501、T502及T511的靶点信息可知，T501靶点序列为5′-gaacagcggcaagtcatcgc-3′，Cas9蛋白切割并产生插入缺失的突变位置距离TMS5翻译起始位点ATG只有22个碱基；T502靶点序列为5′-ccaccgcgccgccaccgggt-3′，Cas9蛋白切割位置距ATG位点57 bp；而T511靶点接近TMS5基因的最末端，距终止密码子TGA只有14个碱基。来源于明恢86和日本晴的突变体中，同一遗传背景的tms5-2突变体与tms5-11突变体间的雄性育性表现无明显差别，但它们的花粉育性及结实率都显著低于tms5-1突变体。与Zhou等[15]设计的10个TMS5基因编辑靶点（TMS5a-TMS5j）相比较发现，其中TMS5f靶点距离ATG最近，位于ATG下游70 bp，该靶点位于本研究设计的T501和T502靶点下游，因此，它们可能未获得类似tms5-1突变体的突变类型。由于获得的tms5-1突变体与tms5-2突变体都是移码突变，而且tms5-1突变位置更靠近ATG，理论上T501位置的移码突变对TMS5蛋白的破坏更彻底，但为何tms5-1突变体表现出更高的起点温度，仅从TMS5蛋白本身无法解释该现象。近年来，Rossi[27]、Ma[28]、El-Brolosy[29]、Rodriguez[30]和马志鹏[31]等发现斑马鱼、小鼠和拟南芥等生物体中存在遗传补偿效应（genetic compensation response），当某种基因被敲除后，生命体会启动遗传补偿程序，通过提高其家族基因的工作效率等方式，以缓冲或弥补基因功能缺失带来的损失。本研究T501靶位点无义突变体的高不育起点温度表型是否也存在部分遗传补偿？从其下游基因UbL40表达分析看，在明恢86或日本晴背景下，tms5-1突变体的3种UbL40的表达量均比tms5-2突变体的低，但比野生型的高，表明tms5-1突变体的UbL40仍可被部分降解，这是否暗示了T501靶位点无义突变体存在部分遗传补偿效应，有待进一步研究。

    综上，本研究不仅在粳稻和籼稻背景相应创制了一批tms5突变体，而且在相同遗传背景（粳稻和籼稻）下创制了tms5-1与tms5-2材料，具有不同的不育起点温度表型，是一类崭新的研究材料，可以克服不同遗传背景的干扰，为研究水稻tms5两系不育起点温度的分子机理及遗传调控网络提供了一种新的策略，具有重要意义。

    4.   结论

    水稻tms5两系不育系的不育起点温度不仅受到遗传背景影响，tms5基因突变位点不同也会影响不育起点温度，特别是T501位点与其余位点突变体间不育起点温度差异显著。

  • 图  1   CRISPR/Cas9系统介导的TMS5基因特异性突变

    A：TMS5基因结构的示意图，黑色矩形代表TMS5的6个外显子，图中短竖线所指位置为各靶点在TMS5基因上的位置。B：CRISPR/Cas9介导的TMS5突变实例，每个靶点只列出了一种突变类型， T505、T508、T510靶点列出的是杂合型突变，T511靶点是双突变，其余位点列出的均为纯合型突变；图上三角形处为缺失或插入突变发生的位置。

    Figure  1.   CRISPR/Cas9-mediated genome editing of tms5

    A.Schematic tms5 structure; black rectangles represent 6 exons of tms5; short vertical line refers to position of each target. B. CRISPR/Cas9-mediated tms5 mutants; only one mutation type is listed for each target; T505, T508, and T510 are listed as heterozygous mutations; T511 as biallelic mutation; and remainders as homozygous mutations; triangles point at deletion and insertion sites.

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    图  2   T1代tms5突变体在田间高温下的花粉育性

    ①A和B：明恢86（A）及日本晴（B）遗传背景的tms5突变体T1代材料花粉育性；两种背景的tms5突变体（依次为T501至T511靶点突变）育性敏感期处于福州8月初的自然长日高温条件；MH86为明恢86，NIP为日本晴；M-#和N-#分别代表明恢86和日本晴遗传背景的突变体。C：明恢86和日本晴两种遗传背景的野生型、tms5-1突变体及tms5-2突变体穗部开花特征。D： M-T501-#1同一穗上出现可育与不育的颖花。②标尺长度：80 µm（A、B）， 0.5 cm（C、D）。

    Figure  2.   Pollen fertility of T1 tms5 mutants under NHT

    ①Aand B: Pollen fertility of tms5 mutants in MH86 (A) and NIP (B) induced at 11 targets from T501 to T511; NHT was in early August in Fuzhou; M-# and N-# are mutant plants of MH86 and NIP, respectively. C: Flowering characteristics of WT, tms5-1, and tms5-2 mutants of NIP and MH86 backgrounds. D: Both fertile and sterile spikelets were set on same panicle of M-T501-#1. ②Scale bars represent 80 μm for A and B, 0.5 cm for C and D.

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    图  3   T2代tms5突变体在不同温度条件下的花粉育性

    ① 22℃ 、24 ℃、28 ℃、NHT分别表示明恢86及日本晴遗传背景的tms5-1及tms5-2突变体在人工气候箱22 ℃、24 ℃、28 ℃及福州8月初自然高温条件下(NHT)的花粉育性。MH86为明恢86，NIP为日本晴，M-#和N-#分别代表明恢86和日本晴遗传背景的突变体。②标尺长度：80 µm。

    Figure  3.   Pollen fertility of T2 tms5 mutants under varied temperatures

    ① Pollen fertility of tms5-1 and tms5-2 mutants of MH86 and NIP backgrounds cultivated at 22 ℃, 24 ℃ or 28 ℃ in phytotrons, or under NHT, respectively; M-# and N-# represent mutant plants of MH86 and NIP backgrounds, respectively. ② Scale bars are 80 μm in length.

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    图  4   Ub L40基因的表达量差异分析

    A、B和C分别表示明恢86及日本晴tms5突变体UbL401、UbL402和UbL404的表达特征，数据为平均数±标准差，n=3。

    Figure  4.   Differential expressions of UbL40

    A, B and C: expressions of UbL401, UbL402, and UbL404 in tms5 mutants of MH86 and NIP, respectively. Data are mean ± standard deviation calculated from 3 replicates.

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    表  1   本试验所用sgRNA序列

    Table  1   sgRNA applied

    靶位点
    Target    		序列（5′- 3′）
    Sequence    		试验目的
    Purpose
    T501S CAGGAACAGCGGCAAGTCATCGC sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T501A AACGCGATGACTTGCCGCTGTTC
    T502S CAGCCACCGCGCCGCCACCGGGT sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T502A AACACCCGGTGGCGGCGCGGTGG
    T503S CAGCACCGTCGAGGGCTACCCCG sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T503A AACCGGGGTAGCCCTCGACGGTG
    T504S CAGCCCATGTACGTCGCCACCCG sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T504A AACCGGGTGGCGACGTACATGGG
    T505S CAGAACCTCGTCCCCCTCGAGAT sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T505A AACATCTCGAGGGGGACGAGGTT
    T506S CAGGTAGGGGTATGTGATATACA sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T506A AACTGTATATCACATACCCCTAC
    T507S CAGATCAAGCAGCTGAAGCTGTC sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T507A AACGACAGCTTCAGCTGCTTGAT
    T508S CAGTGCTTTTACCGGAGATACGA sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T508A AACTCGTATCTCCGGTAAAAGCA
    T509S CAGTGGGCACACCCATCTGTTTG sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T509A AACCAAACAGATGGGTGTGCCCA
    T510S CAGTTCTGCTCGTTATACCGCAG sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T510A AACCTGCGGTATAACGAGCAGAA
    T511S CAGAAGTAGAGTTCATGCATTGA sgRNA构建/
    sgRNA Construction
    T511A AACTCAATGCATGAACTCTACTT
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    表  2   供试引物

    Table  2   Primers selected

    引物名
    Primer name    		序列
    Sequence (5′-3′)    		试验目的
    Purpose
    HptFAGGTCAGGCTCTCGCTAAAC转基因阳性株检测/
    Identify transgenic plants
    Hpt-RACGTAAGGGATGACGCACAAT
    TMS5FCCATCGTGCTTCGTGCCATMS5基因扩增、测序
    PCR and Sanger sequence for TMS5
    TMS5RGAGTTCTTGGTACATGAGTGC
    UBL401FCTACCCCAAGGGGATCGAGReal-Time PCR
    UBL401RGCAAGGCGGTCGATTGAACT
    UBL402FTCGCTCAGGGTCCTCGCCTAReal-Time PCR
    UBL402RCTAGATTCGGCATCCAGTAG
    UBL404FTACACCATCCAGGAGCCCAReal-Time PCR
    UBL404RGGTAGCTGGGCATACGAAG
    ActinFCGTCTGCGATAATGGAACTGReal-Time PCR
    ActinRTCTGGGTCATCTTCTCACGA
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    表  3   各载体转化T0代植株突变分析

    Table  3   Mutation of T0 transgenic plants

    载体
    Construct    		靶点位置
    Target site    		品种
    Variety    		转基因植株数
    Numbers of transgenic plants    		含突变植株数
    Numbers of mutation plants    		突变率
    Mutation rates/%
    TMS501 TMS5第一外显子
    First exon of TMS5    		 Nipponbare 21 15 71.4
    MH86 18 16 88.9
    TMS502 Nipponbare 22 21 95.5
    MH86 11 11 100.0
    TMS503 Nipponbare 29 11 37.9
    MH86 9 6 33.3
    TMS504 Nipponbare 21 11 52.4
    MH86 15 7 46.7
    TMS505 Nipponbare 21 6 28.6
    MH86 21 7 33.3
    TMS506 TMS5第二外显子
    2nd exon of TMS5    		 Nipponbare 19 13 68.4
    MH86 24 21 87.5
    TMS507 Nipponbare 10 2 20.0
    MH86 11 1 9.1
    TMS508 TMS5第三外显子
    3rd exon of TMS5    		 Nipponbare 10 1 10.0
    MH86 18 2 11.1
    TMS509 TMS5第四外显子
    4th exon of TMS5    		 Nipponbare 21 14 66.6
    MH86 18 13 72.2
    TMS510 TMS5第五外显子
    5th exon of TMS5    		 Nipponbare 10 1 10.0
    MH86 15 2 13.3
    TMS511 TMS5第六外显子
    6th exon of TMS5    		 Nipponbare 14 12 85.7
    MH86 11 9 81.8
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    表  4   T1代tms5材料结实率

    Table  4   Seed setting rates of T1 generation of tms5 mutants

    背景
    Background    		材料
    Lines    		突变序列
    § Mutation sequences    		平均结实率
    †Average seed setting rates/%
    明恢86
    MH86    		MH8687.5±4.3 a
    M-T501-#1T501gaacagcggcaagtcatAcgccgg6.9±9.6 b
    M-T501-#2T501gaacagcggcaagtcatTcgccgg4.0±5.6 b
    M-T501-#3T501gaacagcggcaagtcatCcgccgg5.4±6.9 b
    M-T502-#1T502ccaccgcgcc-------ggtc0 c
    M-T502-#2T502ccaccgcgccgccaccgCggtcgg0 c
    M-T502-#3T502ccaccgcgccgccaccgTggtcgg0 c
    M-T511-#1T511gtagagttcatgcat-gaaggaa0 c
    M-T511-#2T511gtagagttcatgcatTtgaaggaa0 c
    M-T511-#3T511gtagagttcatgcatAtgaaggaa0 c
    Nipponbare89.5±2.0 a
    日本晴
    Nipponbare    		N-T501-#1T501gc-----------------gacc48.9±22.1 c
    N-T501-#2T501gaacagcggcaagtca--gccgg54.2±15.8 b
    N-T501-#3T501gaacagcggcaagtcatTcgccgg44.1±12.2 c
    N-T502-#1T502ccaccgcgccg------Cggtcggc10.1±10.2 d
    N-T502-#2T502ccaccgcgccgccaccgAggtcggc8.8±10.1 d
    N-T502-#3T502ccaccgcgccgccaccgTggtcgg9.4±9.6 d
    N-T511-#1T511gtagagttcatgca--gaaggaa9.6±8.4 d
    N-T511-#2T511gtagagttcatgcatCtgaaggaa10.6±10.0 d
    N-T511-#3T511gtagagttcatgcatAtgaaggaa10.4±8.9 d
    ①§靶点位置的大写字母和短划线分别表示插入与缺失突变类型。 ②†结实率为10穗结实率的平均值±标准差。③同列数据后不同小写字母表示依据LSD多重比较，同一遗传背景材料间的差异达显著水平（P＜0.05），下同。
    ①§ Capital letters and dashes at target sites indicate type of insertion and deletion mutations, respectively. ②† Average seed setting rates are mean ± standard deviation calculated from 10 panicles. ③ Data with different lowercase letters on same column indicate significant difference according to LSD multiple comparison (P＜0.05), Same for below.
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    表  5   T2代tms5 突变体花粉育性及自交结实率

    Table  5   Pollen fertility and seed setting rates of T2 tms5 mutants

    植株编号
    Plant ID    		花粉黑染率
    Stained pollens rate/%    		 自交结实率
    Seed setting rate/%
    22 ℃24 ℃28 ℃自然条件
    Natural condition    		 22 ℃24 ℃28 ℃自然条件
    Natural condition
    MH86 86.7±7.8 a 87.1±6.9 a 87.2±5.8 a 88.3±7.1 a 83.4±8.7 a 83.1±6.4 a 85.2±7.2 a 85.9±6.5 a
    M-T501-#1 87.5±10.3 a 61.6±13.5 c 0 b 20.5±11.5 c 67.8±20.3 b 30.7±12.3 c 0 b 8.5±10.6 c
    M-T501-#2 80.1±12.0 b 62.7±10.4 c 0 b 28.2±16.3 b 65.3±16.5 bc 40.2±20.5 b 0 b 21.3±16.3 b
    M-T501-#3 83.3±8.7 ab 71.2±20.2 b 0 b 25.6±15.6 bc 62.2±8.5 c 41.4±17.4 b 0 b 18.7±21.5 b
    M-T502-#1 12.1±10.6cd 0 d 0 b 0 d 1.5±0.3 d 0 d 0 b 0 d
    M-T502-#2 9.3±5.8d 0 d 0 b 0 d 1.8±0.6 d 0 d 0 b 0 d
    M-T502-#3 13.9±10.1 c 0 d 0 b 0 d 1.9±1.3 d 0 d 0 b 0 d
    Nipponbare 92.5±5.9a 90.6±7.3 a 91.1±6.3 a 92.5±6.5 a 87.6±8.2 a 88.1±9.3 a 87.8±6.6 a 90.5±2.3 a
    N-T501-#1 84.2±5.7 b 78.2±20.4 b 35.1±11.3 c 67.4±6.9 c 84.1±8.3 a 66.4±10.6 b 13.1±7.2 c 45.2±33.1 c
    N-T501-#2 86.2±19.5 b 80.2±12.9 b 37.1±8.8 bc 75.7±15.2 b 83.2±7.8 a 68.5±10.3 b 14.8±5.1 bc 52.1±35.8b
    N-T501-#3 82.3±21.2 b 80.1±18.1 b 40.1±10.5 b 69.1±9.6 c 83.1±10.9 a 50.5±12.2 c 18.6±9.5 b 50.7±28.3 bc
    N-T502-#1 82.2±6.8 b 70.0±20.2 c 6.1±2.5 d 25.2±19.0 e 72.3±9.2 bc 35.3±28.1 d 3.5±1.6 c 14.1±11.2 d
    N-T502-#2 85.5±6.3 b 72.2±18.5 c 7.6±6.6 d 31.1±16.9d 75.8±12.3 b 33.4±16.9 d 7.5±8.1 c 18.6±10.3 d
    N-T502-#3 84.1±9.2 b 70.5±16.7 c 9.2±8.1 d 26.3±27.7 e 69.6±9.2 c 25.4±20.3 e 4.2±2.5 c 17.6±16.3 d
    花粉黑染率及自交结实率均为5株的平均值，自然条件指福州8月份的长日高温条件。
    Data are means on 5 plants; NHT was defined as long day and high temperature in August in Fuzhou.
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-05-11
  • 修回日期:  2023-05-21
  • 网络出版日期:  2023-08-15
  • 刊出日期:  2023-07-27

目录

摘要
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  • 0.   引言

  • 1.   材料与方法

  • 1.1   试验材料

  • 1.2   试验方法

  • 1.2.1   载体构建及遗传转化
  • 1.2.2   基因型鉴定
  • 1.2.3   材料种植管理与光温处理
  • 1.2.4   花粉育性鉴定
  • 1.2.5   UbL40表达量检测

  • 2.   结果与分析

  • 2.1   不同TMS5基因编辑载体的靶向突变效率分析

  • 2.2   tms5突变体田间育性鉴定

  • 2.3   tms5突变体人工气候箱育性鉴定

  • 2.4   UbL40基因的差异表达分析

  • 3.   讨论

  • 4.   结论

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