LED-stimulated Levodopa Production in Broad Bean Sprouts
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摘要:目的 研究不同LED光培养条件对蚕豆芽苗菜功效成分左旋多巴产量的影响。方法 通过单因素试验和L9（34）正交试验研究不同光强、光照时间和培养时间3个因素对蚕豆芽苗菜生长及其功效物质左旋多巴产量的影响。结果 弱光促进蚕豆芽苗菜干物质的积累，强光促进蚕豆芽苗菜左旋多巴质量分数的积累，蚕豆芽苗菜高左旋多巴产量的最优培养条件为光强500 lx、光照时间9 h、培养时间6 d，在此培养条件下蚕豆芽苗菜左旋多巴产量为19.62 g·m−2。结论 通过调节蚕豆芽苗菜的光培养条件可以提高其功效物质左旋多巴的产量，本研究为蚕豆芽苗菜的功效物质成分提取提供参考依据，有利于蚕豆芽苗菜的开发利用。Abstract:Objective Effect of LED photoculture on yield of levodopa in broad bean sprouts was studied.Method Broad bean sprouts were exposed to LED of varied intensity and cultured for varied time periods in single factor and L9 (34) orthogonal experiments. Levodopa generated in the sprouts under the conditions was determined for process optimization.Result Low LED light enhanced the accumulation of sprout dry matters. However, it was under high intensity the productivity of levodopa in the sprouts was significantly encouraged. The optimum conditions for a maximized levodopa production of 19.62 g·m−2 were found to include 9 h of 500 lx LED exposure in 6 d of cultivation.Conclusion The photoculture of broad bean sprouts under intense LED lights could significantly promote the production of the functional amino acid, levodopa.
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Keywords:
- Broad bean sprouts /
- orthogonal test /
- LED light intensity /
- levodopa
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0. 引言
【研究意义】芽苗菜是指各种植物种子或其他贮存营养的器官在一定条件下培育出可食用的芽苗、嫩茎、幼梢、幼茎等的总称[1]，也称“活体蔬菜”[2]。芽苗菜含有丰富的氨基酸[3]、异黄酮[4]、维生素[5]、酚类[6]等功效成分，同时芽苗菜生长过程能分解抗营养因子，提高营养成分含量[7, 8]，促进人体对蛋白质等的吸收利用[9]，芽苗菜生产安全无污染，口感脆嫩，风味独特，深受消费者喜爱[10-12]，其中以绿豆、黄豆、蚕豆等豆类种子生产的芽苗菜已成为芽苗菜家族的主力军，占有稳定的市场份额[13, 14]。蚕豆芽苗菜含有丰富的蛋白质、维生素、微量元素和膳食纤维[15]，能够促进机体酸碱平衡，促进人体消化吸收，具有抗氧化[16]、降血脂、提高免疫力等功效。近年来，有研究表明蚕豆芽苗菜中还含有丰富的左旋多巴物质[17]，左旋多巴是人体神经递质多巴胺的前体物质，是治疗和预防帕金森病最有效的物质[18]。蚕豆芽苗菜是生产左旋多巴的良好原料[19]，因此研究蚕豆芽苗菜高左旋多巴产量的培养条件对蚕豆的利用具有重要意义。【前人研究进展】目前，在研究蚕豆芽苗菜左旋多巴时，蚕豆芽苗菜生长过程中的光照条件通常采用黑暗条件，苌淑敏等[20]对不同光照时间下蚕豆芽苗菜的生长指标和营养指标进行研究，结果表明蚕豆芽苗菜生产的最适合光照时间为9 h·d−1；刘一静等[21]对不同光质对蚕豆芽苗菜生长和营养品质进行研究，结果表明波长为（658±10） nm、光通量密度为30 mmol·m−2·s−1的蓝光处理能提高芽苗菜的营养品质。【本研究切入点】有关光照强度对蚕豆芽苗菜生长情况和功效成分含量影响的相关报道鲜见。【拟解决的关键问题】本研究利用单因素试验结合L9（34）正交试验对LED光照强度、光照时间和培养时间对蚕豆芽苗菜的生长和功效成分含量的影响进行研究，以期得出蚕豆芽苗菜左旋多巴产量最高的生产条件，为蚕豆芽苗菜的生产发展提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
河北崇礼“陵西一寸”蚕豆种子
1.2 试验仪器和试剂
试剂：乙腈、甲醇为HPLC级，墨客公司；冰醋酸、甲酸为GR级，盐酸、磷酸为AR级，为国药集团化学试剂有限公司生产；左旋多巴标准品（中国药品生物制品检定所）。
仪器：Agilent1200系列液相色谱仪；SHZ－D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；TP-214 电子天平（DENVER INSTRUMENT）；SB-5200DTDN数控超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；0.45μm微孔滤膜（上海兴亚净化材料厂）；TES-1330A光照度计（泰仕电子工业股份有限公司）；LED灯管照明系统（红光波长630~660 nm，蓝光波长450~460 nm，蓝红光光强比例1/4，参照文献[22, 23]）。
1.3 试验方法
1.3.1 蚕豆芽苗菜无基质栽培种植
选取大小和重量基本相同、健康完整的蚕豆种子，浸种10 h，期间每隔2 h换水1次，浸种后用0.1%多菌灵清洗杀菌，用蒸馏水冲洗3遍，均匀铺于育苗盘中，播种密度为1800粒·m−2，在温度为25 ℃条件下对蚕豆芽苗菜进行栽培，每隔3 h淋水1次，培养时间为9 d（前期预试显示，蚕豆芽苗菜在25 ℃下培养9 d后，芽苗菜生长趋缓，纤维化加快，口感急剧恶化，所以本试验以9 d作为培养终期）。
1.3.2 蚕豆芽苗菜培养条件单因素试验
参照文献[20]的试验方法，设置3个单因素试验，固定光照时间为9 h，培养时间为7 d，光照强度分别为黑暗和250 、500、750 、1000 lx；固定光照强度为500 lx（光强用TES-1330A光照度计进行测定），培养时间为7 d，光照时间分别为3 、6 、9 、12 、15 h；固定光照强度为500 lx、光照时间为9 h，培养时间分别为1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 d。每个处理重复3次。
1.3.3 HPLC色谱条件
色谱柱：资生堂CAPCELL PAK CR色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相的配比：CH3CN∶0.1% HCOOH体积比为5∶95。流动相的流速：1.0 mL·min−1；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。流动相使用前经0.45 μm滤膜过滤。
1.3.4 标准品的制备
精密称取L-Dopa标准品10 mg置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol·L−1 HAC溶液溶解，定容至刻度，摇匀，使之成为1000 mg·L−1的标准贮备液，备用。
1.3.5 L-Dopa标准曲线
精密移取1.6 ml、800 μL、400 μL、200 μL、100 μL、50 μL、10 μL的标准储备液分别置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol·L −1HAC定容至刻度，摇匀，配制成160 、80 、40 、20 、10 、5 、1 μg·mL−1的标准溶液。在确立的HPLC色谱条件下，分别测定以上各标准浓度系列样品，重复3次。以L-Dopa浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标做标准曲线，进行线性回归，计算相关系数。
1.3.6 供试品溶液的制备
蚕豆芽样品经40 ℃干燥48 h后，粉碎机粉成细粉，过筛（200目）。精密称取粉末0.01 g，置于10 mL刻度试管中，加入0.1 mol·L−1 HAC溶液5 ml，超声处理30 min，过滤。取滤液1.0 mL至10 mL容量瓶，0.1 mol·L−1 HAC溶液定容至刻度，即得供试品溶液。HPLC测定蚕豆芽左旋多巴质量分数。重复3次，以平均质量分数进行比较分析。
1.3.7 供试品溶液左旋多巴质量分数的测定
外标法测定，抽取供试品溶液20 μL，进样，走完峰后洗柱，重复3次，得出样品左旋多巴浓度，计算样品左旋多巴质量分数。计算公式
W=C×V×nm×103×100%, 其中：W为样品左旋多巴质量分数/%；C为待测样品左旋多巴的质量浓度/mg·mL−1；V为待测液体积/mL；n为稀释倍数；m为蚕豆芽干重/g。
1.4 数据处理
采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0软件设计因素水平表，并进行方差分析，采用GraphPad Prism 5软件进行作图。
2. 结果与分析
2.1 不同光照条件下蚕豆芽苗菜左旋多巴产量单因素试验及分析
2.1.1 培养时间对蚕豆芽苗菜左旋多巴产量的影响
由图1可以看出，在光照强度500 lx、光照时间9 h条件下，蚕豆芽苗菜的芽长和干重均随着培养天数的增加而升高，而蚕豆芽苗菜的左旋多巴质量分数和产量随着培养天数的增加先上升后下降，其中蚕豆芽苗菜左旋多巴质量分数在第2 天时达到最大值，左旋多巴产量在培养7 d时达到最高，可见单因素试验中蚕豆芽苗菜培养时间选择7 d为宜，因此正交试验的培养天数选择6 、7 、8 d。
2.1.2 光强对蚕豆芽苗菜左旋多巴产量的影响
由图2可以看出，在光照时间9 h，培养7 d条件下，在黑暗时蚕豆芽的芽长生长最快，且总体上呈现出光照越强，蚕豆芽的芽长生长越慢的趋势；弱光条件下（250 lx）蚕豆芽苗菜干重最大，强光条件下（1000 lx）蚕豆芽苗菜干重最小；在光照的处理条件下，蚕豆芽苗菜左旋多巴质量分数显著高于黑暗处理的蚕豆芽苗菜；在中弱光强条件下蚕豆芽左旋多巴的产量较高，其中在光照强度为500 lx条件下蚕豆芽左旋多巴的产量达到最大值，因此正交试验的光照强度选择250、500 、750 lx。
2.1.3 光照时间对蚕豆芽苗菜左旋多巴产量的影响
由图3可以看出，在光照强度500 lx、培养9 d条件下，蚕豆芽苗菜的芽长和干重随着光照时间的增加而下降，左旋多巴质量分数随光照时间的增加而上升，左旋多巴产量随光照时间的增加先上升后下降，其中在光照时间为9 h时达到最大值，因此正交试验的光照时间选择6 、9 、12 h。
2.2 不同光照条件下蚕豆芽苗菜左旋多巴产量正交试验
在单因素试验的基础上，每个因素设计 3 个水平（表1），进行L9（34）正交试验，结果（表2、表3）显示，对蚕豆芽苗菜左旋多巴产量的影响排序是：光强＞光照时间＞培养时间，且光强和光照时间对左旋多巴产量的影响具有显著性，培养时间对左旋多巴产量没有显著性影响。因此得出蚕豆芽苗菜生产左旋多巴的最佳培养条件为B2C2A1，即光强为500 lx，光照时间为9 h，培养时间为6 d，在此条件下蚕豆芽苗菜左旋多巴产量为19.62 g·m−2。
表 1 因素水平Table 1. Factors and levels of orthogonal experiment水平
Level因素 Factor A培养时间
Culture time/dB 光强
Light intensity/lxC 光照时间
Light time/h1 6 250 6 2 7 500 9 3 8 750 12 表 2 蚕豆芽苗菜左旋多巴产量的正交试验结果与分析表Table 2. Orthogonal test results and analysis on levodopa produced in broad bean sprouts编号
Number因素 Factor 左旋多巴产量
Levodopa yield/（g·m−2）A培养时间
Culture timeB光强
Light intensityC光照时间
Light time空列
Empty column1 1 1 1 1 16.83 2 1 2 2 2 19.62 3 1 3 3 3 17.56 4 2 1 2 3 19.26 5 2 2 3 1 19.55 6 2 3 1 2 16.87 7 3 1 3 2 18.64 8 3 2 1 3 18.64 9 3 3 2 1 18.06 K1 54.01 54.73 52.34 54.44 K2 55.68 57.81 56.94 55.13 K3 55.34 52.49 55.75 55.46 k1 18.00 18.24 17.45 18.15 k2 18.56 19.27 18.98 18.38 k3 18.45 17.50 18.58 18.49 极差 Range 0.56 1.77 1.53 0.34 因素主次 Factor primary and secondary B＞C＞A 优水平 Excellent level A2 B2 C2 优组合 Excellent combination B2C2A2 表 3 方差分析Table 3. Analysis of variance因素
Factor偏差平方和
Sum of squares of
deviations自由度
Degree of
freedomF值
F value显著性
SignificanceA 0.52 2 2.89 — B 4.75 2 26.37 * C 3.80 2 21.10 * F0.05（2，2）=19，当F＞19说明有显著性意义，*P＜0.05。
F0.05（2，2）=19， F ＞19 means significant difference (P＜0.05).3. 讨论与结论
3.1 培养条件对蚕豆生长发育的影响
黑暗中蚕豆芽苗菜的芽长最长，且随着光强的增加，蚕豆芽的芽长生长发育变慢，这与刘国顺等[24]在烤烟幼苗和骆郴等[25]在拟南芥中的研究结果一致，这可能是由于在弱光条件下芽苗菜下胚轴中赤霉素和生长素等植物激素大量合成，促进了下胚轴的伸长[26]。在弱光条件下（250 lx）蚕豆芽苗菜干重最大，强光条件下（1000 lx）蚕豆芽苗菜干重最小，这与杨伟波等[27]和张毅华等[28]的研究结果一致，杨伟波等研究发现弱光条件下会促进义安油茶幼苗的茎粗和地上部生物量，张毅华等的研究发现弱光有利于黑豆芽苗菜下胚轴的增粗并可保持较高的可食鲜质量，这可能与植物的形态可塑性相关，当光强减弱时，植株幼苗的株高生长量、地上生物量会增加，以捕获更多光能，适应复杂的光环境[29]。
随着光照时间的增加，蚕豆芽苗菜的芽长和干重都减少了，说明光照时间增加会抑制蚕豆芽苗菜的增长和增重，作物的形态和发育变化很多都与光照时间紧密相关，这也说明了蚕豆对光照时间的反应很敏感，该结果与马超[30]对大豆芽苗菜的研究结果相似。
3.2 培养条件对蚕豆芽苗菜左旋多巴质量分数的影响
在光照的处理条件下，蚕豆芽苗菜左旋多巴质量分数显著高于黑暗处理的蚕豆芽苗菜，说明光能够增加蚕豆芽苗菜左旋多巴的储存，这与前人的研究结果一致[21]。蚕豆芽左旋多巴质量分数随光照强度和光照时间的增加而上升，这可能是由于光强和光照时间增加，蚕豆芽苗菜中叶绿体产生的葡萄糖也增加，增强了磷酸戊糖代谢途径，从而增加了左旋多巴质量分数[31]。
综上所述，弱光促进蚕豆芽干物质的积累，强光促进蚕豆芽左旋多巴质量分数的积累，兼顾培养时间、光强和光照时间之间的相互作用，得出蚕豆芽苗菜生产左旋多巴的最适光照强度为500 lx，光照时间为9 h，培养时间为6 d，其左旋多巴产量达到19.62 g·m−2。
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表 1 因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
水平
Level因素 Factor A培养时间
Culture time/dB 光强
Light intensity/lxC 光照时间
Light time/h1 6 250 6 2 7 500 9 3 8 750 12 
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表 2 蚕豆芽苗菜左旋多巴产量的正交试验结果与分析表
Table 2 Orthogonal test results and analysis on levodopa produced in broad bean sprouts
编号
Number因素 Factor 左旋多巴产量
Levodopa yield/（g·m−2）A培养时间
Culture timeB光强
Light intensityC光照时间
Light time空列
Empty column1 1 1 1 1 16.83 2 1 2 2 2 19.62 3 1 3 3 3 17.56 4 2 1 2 3 19.26 5 2 2 3 1 19.55 6 2 3 1 2 16.87 7 3 1 3 2 18.64 8 3 2 1 3 18.64 9 3 3 2 1 18.06 K1 54.01 54.73 52.34 54.44 K2 55.68 57.81 56.94 55.13 K3 55.34 52.49 55.75 55.46 k1 18.00 18.24 17.45 18.15 k2 18.56 19.27 18.98 18.38 k3 18.45 17.50 18.58 18.49 极差 Range 0.56 1.77 1.53 0.34 因素主次 Factor primary and secondary B＞C＞A 优水平 Excellent level A2 B2 C2 优组合 Excellent combination B2C2A2
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表 3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
因素
Factor偏差平方和
Sum of squares of
deviations自由度
Degree of
freedomF值
F value显著性
SignificanceA 0.52 2 2.89 — B 4.75 2 26.37 * C 3.80 2 21.10 * F0.05（2，2）=19，当F＞19说明有显著性意义，*P＜0.05。
F0.05（2，2）=19， F ＞19 means significant difference (P＜0.05).
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