Anti-TMV Activity of Chemicals in Leaves and Branches of Ailanthus altissima
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摘要:目的 对臭椿（Ailanthus altissima）化学成分及其抗烟草花叶病毒（TMV）活性进行研究，为开发新型植物病毒抑制剂提供理论依据。方法 综合运用硅胶、凝胶、MCI等多种柱层析方法对臭椿枝叶正丁醇提取物化学成分进行分离，利用NMR、MS鉴定其结构；以TMV为供试病毒，采用半叶枯斑法从保护活性、治疗活性、钝化活性等3个方面评估化合物的生物活性。结果 从臭椿枝叶正丁醇提取物中分离鉴定了17个化合物，根据其理化性质以及波谱数据分别鉴定为：山奈酚（Kaempferol） (1)、(2S)-3-O-Octadeca-9Z,12Z,15Z-trienoylgycery-O-β-D-galactopyranoside (2)、正二十六烷（Hexacosane） (3)、6,9,12-Octadecatrienoic acid (4)、Eichlerianic acid (5)、 Colocasinol A (6)、咖啡酸二十烷酯（Caffeic acid eicosanyl ester） (7)、Acernikol (8)、(-)-Sakuyayesinol (9)、(14S,17S,20S,24R)-20,24,25-trihydroxy-14,17-cylomalabarican-3-one (10)、Pinnata E(11)、morin-3-O-α-rhamnopyranoside(12)、Trans-syringin (13)、姜糖脂A（Gingerglycolipid A） (14)、姜糖脂B（gingerglycolipid B）(15)、benzyl 2-O-β-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-2,6-dihydroxy-benzoate (16)、picrorhizoside C (17)。化合物2、14、15为首次从该植物中分离得到。在质量浓度为50 μg·mL-1时，化合物6、8、13、14对TMV的钝化活性较为显著，抑制率均在50%以上，与阳性对照药剂宁南霉素无显著差异，分别为木脂素类化合物、木脂素类化合物、苯丙素类化合物和半乳糖脂类化合物。结论 从臭椿枝叶中分离得到的17个化合物，均对TMV具有抑制作用，部分半乳糖脂类化合物、木脂素类化合物、苯丙素类化合物对TMV有显著的钝化作用，研究结果丰富了臭椿抗TMV活性物质的范畴，也为今后开发新型植物病毒抑制剂提供了科学依据。Abstract:Objective Chemical composition and anti-tobacco mosaic virus (TMV) activity of Ailanthus altissima were studied to pave the way for developing an effective viral inhibitor.Methods Substrates in the n-butanol extract of leaves and branches of A.altissima plants were separated using silica gel, Sephadex LH-20, and MCI column chromatography.Chemical structures of the substrates were determined based on NMR and MS data, and anti-TMV activity of the compounds examined using the half-leaf method.Results The 17 compounds isolated from the n-butanol extract were identified to be: (1) kaempferol, (2) (2S)-3-o-octadeca-9Z, 12Z, 15Z-trienoylgycery-O-β-D-galactopyranoside, (3) hexacosane, (4) 6,9,12-octadecatrienoic acid, (5) eichlerianic acid, (6) colocasinol A, (7) caffeic acid eicosanyl ester, (8) acernikol, (9) (-)-Sakuyayesinol (10), (14S,17S, 20S, 24R)-20,24,25-trihydroxy-14,17-cylomalabarican-3-one, (11) 4-(3-butoxy-1-hydroxy-2-methoxypropyl) benzene-1, 2-diol, (12) pinnata, (13) trans-syringin, (14) gingerglycolipid A, (15) gingerglycolipid B, (16) benzyl 2-o-β-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-2,6-dihydroxy-benzoate, and (17) picrorhizoside C.Among them, Compounds 2, 14, and 15 were isolated from the plant for the first time.And the lignans, phenylpropanoids, or galactose lipids, such as Compounds 6, 8, 13, and 14 at concentration of 50 μg·mL−1 displayed a TMV inactivation rate greater than 50%, which was similar to that of the positive control, ningnamycin.For Compounds 6, 13, and 14, the rates were even higher than that of ningnamycin.Conclusion All 17 substances isolated from the leaves and branches of A.altissima exhibited varying degrees of inhibitory effect on TMV.The efficacy was more significant as shown by certain Lignans, phenylpropanoids, and galactose lipids.
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在植物体内，参与蔗糖合成与转化的酶主要有3种：蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)、蔗糖合成酶(sucrose synthase, SuSy)和转化酶(invertase, INV)，其中SPS是蔗糖代谢系统中最重要的限速酶[1-2]，其广泛存在于高等植物叶片、果实、贮藏块根、块茎等中，直接调控植物体内蔗糖和淀粉的合成与分配，催化UDPG (尿苷二磷酸葡萄糖)+F-6-P (6-磷酸果糖)→UDP (鸟嘌呤核糖核苷酸)+G-6-P (6-磷酸蔗糖)反应的进行，从而促进蔗糖合成与转化[3-4]。SPS基因经发现后首次从玉米中被克隆出来[5]，之后国内外学者先后从菠菜[6]、甜菜[7]、柑橘[8]、蚕豆[9]、水稻[10]、甜瓜[11]、甘蔗[12-13]、枸杞[14]等多种作物中克隆出SPS基因。黄东亮等[2]对所有已知SPS基因全长序列进行分析后，认为SPS基因可分为A、B、C、D等4个家族，但是Castleden等[15]对小麦等单子叶植物的SPS基因序列进行研究后认为植物SPS基因大体可以分为5个家族，分别为A、B、C、DIII和DIV。不同植物体基因组中含有多个SPS基因，每个SPS基因分属于不同家族，在柑橘中有3个SPS基因，分别属于A、B、C等3个家族；在模式植物拟南芥中有4个SPS基因，其中2个基因属于A家族，另外2个分别属于B、C家族[16]；水稻中有5个SPS基因，分别属于A、B、C、DIII、DIV等5个家族[17]；玉米中则至少含有7个SPS基因，其中A、B、DIII家族中各含有1个，B、DIV家族中各含有2个[18]。木薯Manihot esculenta Crantz是大戟科木薯属多年生经济作物，其叶片、茎、块根中均有SPS的存在，参与和调控木薯体内的蔗糖代谢。研究结果表明，木薯体内蔗糖含量与块根淀粉积累量存在密切关系[19-20]，因此克隆和分析木薯SPS基因编码序列及其在不同组织中的表达，对今后研究该基因的功能及木薯体内蔗糖和淀粉的合成与分配机制具有重要意义。目前，有关木薯SPS基因的克隆、表达分析等研究鲜见报道。本研究以木薯根、茎、叶为材料，在GenBank中找到已注册且具有高度同源性的植物SPS基因序列设计特异性引物，采用PCR技术和RACE技术克隆木薯SPS基因全长cDNA序列，并利用实时荧光定量PCR技术对其在不同时期、不同组织中的表达情况进行分析，为进一步研究该基因在木薯中的生物学功能奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验材料
选取木薯品种辐选01(RS01)为材料，于2015年春种植于广西大学农学院科研教学基地，分别于苗期(60 d)、块根形成期(120 d)、块根膨大期(180 d)、块根成熟期(240 d)采集叶片、茎段和块根为材料，经液氮速冻后于-80℃冰箱保存备用。
1.1.2 试剂
Quick Plant RNA Islation Kit试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司，PrimeScriptTMII Fiest Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)、TdT、RnaseH、PMD18-T vecter、dCTP、dNTP等均购自大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、氨苄青霉素(Amp)均购自上海生工生物工程有限公司，Es Taq MasterMix (含染料)购自北京康为世纪生物科技有限公司，ChamQ SYBR qPCR MasterMix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α购自北京天根生化科技有限公司，其他生化试剂均为国产分析纯。
1.1.3 PCR引物
基因克隆及实时荧光定量PCR所用引物均采用Primer 5.0软件设计并委托上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列见表 1。
表 1 基因克隆及实时荧光定量PCR引物序列Table 1. Primers for MeSPS gene cloning and qPCR引物名称 引物序列(5′-3′) MeSPS-F ATGGCTGGCAACGATTGGATT MeSPS-R CTATCCCTTGACACATGCTAATTGC MeSPS-5A CGACGAAATAGCGAGTGGGACTAAACCTT MeSPS-5B GACGACTTAGCATCATCCAGGC MeSPS-3F ATGCCAACAGAAACTACCCGCTCGC 3′RACE通用引物 GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT MeSPS-qF TGATACGGGTGGTCAGGTT MeSPS-qR CTGTGGGCTCACCATAACTC Actin-F CGATGGTCGTACAACTGGTAT Actin-R ATCCTCGAATCCAGACACTGT 1.2 试验方法
1.2.1 总RNA提取及cDNA合成
取0.5~1.0 g木薯生长中期叶片、茎段、块根混合材料，液氮中迅速研磨成粉末，根据Quick Plant RNA Islation试剂盒说明提取总RNA，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，用超微量核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度。参照Prime ScriptTMII Fiest Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒说明合成cDNA。
1.2.2 木薯SPS基因保守区的克隆
利用Dnaman 6.0软件分析已知的具有高度同源性的多种近源植物SPS基因的核苷酸序列，在保守区域设计一对特异性引物，上游引物MeSPS-F，下游引物MeSPS-R。以逆转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系(50.0 μL)：cDNA模板2.0 μL，2×Es Taq MasterMix (含染料)25.0 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各2.0 μL，ddH2O 19.0 μL。扩增程序：94℃预变性2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2.5 min，进行35个循环；最后72℃延伸2 min。将PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，将目的片段连接到pMD18-T载体，转化到肠杆菌感受态细胞DH5α，进行蓝白斑筛选，将经PCR鉴定后的阳性克隆送至上海生工生物工程股份有限公司测序。
1.2.3 木薯SPS基因5′末端RACE扩增
根据克隆得到的木薯SPS基因保守片段，设计2条下游巢式特异引物MeSPS-5A、MeSPS-5B;具体方法参照罗聪等[21]的5′RACE技术进行PCR扩增。反应完成后将扩增产物1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并将目的条带回收、连接、转化、鉴定后送阳性克隆到上海生工测序。
1.2.4 木薯SPS基因3′末端RACE扩增
根据克隆得到的木薯SPS基因保守片段，设计3′-RACE上游特异性引物MeSPS-3F，参照朱顺义等[22]的两步PCR法进行3′-RACE扩增，以1.2.1逆转录获得的cDNA为模板。PCR体系(50.0 μL)：cDNA模板2.0 μL，2×Es Taq MasterMix (含染料)25.0 μL，10 μmol·L-1上游引物2.0 μL，ddH2O 19.0 μL。反应程序：95℃ 60 s，58℃ 60 s，72℃ 2 min，15个循环后加入3′RACE通用引物2.0 μL，将退火温度提高到64℃，其他条件不变，继续进行30个循环，最后72℃延伸5 min。PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，并将目的条带回收、连接、转化、鉴定后送阳性克隆到上海生工测序。
1.2.5 木薯SPS基因生物信息学分析
利用ORF Finder程序对获得的基因序列进行开放阅读框(ORF)查找分析，并推到其氨基酸序列；运用NCBI在线软件BLAST对所得基因的核苷酸序列和氨基酸序列与其他植物进行同源性比对分析；用Protparam程序分析该基因编码氨基酸组成、理论分子量和等电点等理化性质；利用WOLF PSORT在线软件对蛋白质进行亚细胞定位分析；利用SOPMA在线程序进行蛋白质二级结构的预测和分析；使用在线工具SWISS-MODEL进行蛋白质的三维结构预测。
1.2.6 木薯SPS基因的表达分析
分别取木薯苗期、块根形成期、块根膨大期、块根成熟期的叶片、茎段、块根为材料，提取总RNA并进行反转录。以持家基因Actin为内参，采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)，检测各cDNA样品中SPS基因的相对表达量。按照标准荧光定量PCR引物设计原则设计引物MeSPS-qF、MeSPS-qR及内参基因引物Actin-F、Actin-R。qRT-PCR反应体系为：2×ChamQ SYBR qPCR MasterMix 10.0 μL，10 μmol·L-1 MeSPS-qF 0.4 μL，10 μmol·L-1 MeSPS-qR 0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，40个循环，每个样品3个重复。完成上述步骤后，将加好的样品放在Bio-Rad CFX96TM荧光定量PCR仪中进行反应，反应完成后进行熔解曲线检测，根据荧光PCR扩增Ct值，按照2-ΔΔCt方法计算出基因相对表达量。
2. 结果与分析
2.1 木薯总RNA提取及检测
琼脂糖凝胶电泳结果(图 1)表明，提取的木薯总RNA质量较高，有明显的28S、18S和5S条带，没有糖及蛋白质污染，且条带清晰、无弥散现象。测定总RNA浓度为0.6~1.2 μg·μL-1，OD260/OD280值为1.90~2.07，能满足后续试验的要求。
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图 1 木薯总RNA注：M为DL2000 DNA Maker; 1~2为木薯总RNA conservative region。Figure 1. Total RNA of cassava2.2 木薯SPS基因全长克隆
以逆转录获得的cDNA为模板，用MeSPS-F、MeSPS-R引物进行PCR扩增，获得一条3 000 bp左右的条带(图 2)，与预期结果相符。将目的基因经过连接、转化、菌液鉴定及测序比对后，得到3 074 bp的中间目的片段，经过BLAST比对分析，结果显示该序列与麻风树、蓖麻的SPS基因序列同源性均高达89%，由此可初步判定该序列为木薯SPS基因的一个中间目的片段。用2条巢式特异下游引物MeSPS-5A和MeSPS-5B进行5′末端RACE扩增，获得400左右的目的条带(图 3，箭头所示)，经测序分析该目的片段长度为392 bp。利用MeSPS-3F和通用引物对木薯SPS基因3′末端进行RACE扩增，获得500 bp左右的目的片段(图 4，箭头所示)，经测序分析后该目的片段长度为543 bp。将获得的木薯SPS基因中间目的片段、5′RACE扩增片段和3′RACE扩增片段进行拼接后，获得了木薯SPS基因全长cDNA序列为3 857 bp。在NCBI中的BLASTn比对分析显示，该基因序列与同属植物麻风树Jatropha carcasL.、蓖麻Ricinus communisL.的同源性均为89%，与荔枝Litchi chinensisSonn.的同源为87%，与胡杨Populus euphratica、温州柑橘Citrus unshiu、龙眼Dimocarpus longanLour.、桃Amygdalus persicaL.等植物的同源性均为83%，表明已成功克隆木薯SPS基因，命名为MeSPS (GenBank登录号KX822780)。
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图 2 MeSPS保守区PCR扩增结果注：DL5000 DNA Maker; 1为PCR产物。Figure 2. Amplification results on MeSPS![]()
图 4 3′末端RACE扩增结果注：M为DL2000 DNA Maker; 1~2为3′RACE产物。Figure 4. 3′RACE amplified results2.3 木薯SPS基因生物信息学分析
木薯SPS基因全长3 857 bp，其中5′端非编码区长211 bp，3′端非编码区长412 bp，ORF长3 228 bp，编码1 076个氨基酸，终止密码子为TAG，3′端具有真核生物典型的poly (A)尾(图 5)。将该基因编码的氨基酸序列在NCBI中进行BLASTp比对分析显示，该氨基酸序列与其他植物SPS氨基酸同源性在77%~92%，其中，与麻风树Jatropha carcas L.，XP012081178.1、胡杨Populus euphratica，XP011020206.1、龙眼Dimocarpus longanLour.，AJW82919.1、芒果Mangifera indicaL.，BAM37540.1的相似性较高，分别为92%、88%、87%、86%。Protparam程序预测该基因编码的蛋白质相对分子质量为119.97 kD，理论等电点为6.15，属于非稳定蛋白质。亚细胞定位分析表明，MeSPS所编码的蛋白质定位于细胞核中，在叶绿体中也有分布。其蛋白质二级结构预测结果表明，该蛋白含有413个α螺旋，占38.38%；201个延伸连，占18.68%；105个β转角，占9.76%；357个无规则蜷曲，占33.18%。进一步用工具对MeSPS蛋白质进行同源建模，获得该蛋白的三维结构如图 6所示。
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图 5 MeSPS基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列Figure 5. Nucleotide sequence of MeSPS gene and its deduced amino acid sequence2.4 木薯SPS基因表达分析
不同植物SPS基因在不同组织、时间、胁迫诱导等条件下，其基因表达量存在明显差异，通过荧光定量PCR分析MeSPS在不同生长时期的叶片茎段、块根中的相对表达量结果如图 7表示。由图可知，MeSPS在不同组织、不同时期的相对表达量差异很大。在苗期的相对表达量较高，而其他时期的表达量低，在叶片和茎段中的表达量均呈先下降后升高的趋势，其原因可能是木薯块根形成后主要以合成淀粉为主，蔗糖合成减少，从而使SPS基因表达量降低，到块根成熟时期淀粉合成减缓，SPS基因表达量有所升高。在同一时期SPS基因在叶片中的表达量均高于根和茎，说明SPS基因在光合组织中存在较多，参与光合作用过程中蔗糖的合成与分配。
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图 7 MeSPS在不同组织、不同时期的相对表达量Figure 7. Relative expressions of MeSPS in various tissues at different times3. 讨论与结论
蔗糖是植物体内主要的光合产物，同时也是植物体内“源”→“库”运输的主要形式[23]在植物生长发育过程中起着极其重要的作用。蔗糖磷酸合成酶(SPS)是蔗糖代谢过程中最重要的限速酶，研究其在蔗糖代谢中的调控机制及其基因克隆，成了近年来植物蔗糖研究领域的热点。目前，有关大戟科植物SPS基因克隆的研究报道较少，且木薯SPS基因的克隆也尚未报道。本研究首次克隆了木薯SPS基因全长cDNA序列，该基因全长为3 857 bp，ORF长3 228 bp，编码一个含1 076个氨基酸的多肽，该基因序列与同属植物麻风树、蓖麻的同源性均高达89%，与荔枝的同源为87%，与胡杨、温州柑橘、龙眼、桃等植物的同源性均为83%；其蛋白质分子量为119.97 kD，理论等电点为6.15，为酸性非稳定蛋白，该蛋白含有413个α螺旋，201个延伸连，105个β转角，357个无规则蜷曲，亚细胞定位分析显示，该蛋白主要定位于细胞核中，在叶绿体中也有分布，这进一步说明MeSPS基因所编码的蛋白质可能参与叶片光合作用，为研究蔗糖合成机制提供理论依据。
植物SPS基因主要在光合组织(叶片)中表达，在其他非光合组织中也有表达[24-25]，不同SPS基因家族在不同组织中的表达量具有差异性。Grof等[26]测定了甘蔗中A、B、C、D1、D2等5个SPS基因家族在各组织中的表达量，发现A家族在叶片中的表达量较低，B、C家族在未成熟叶和成熟叶中均表达量较高，D1、D2家族在茎、叶中等量表达。Okamura等[27]研究了水稻5个SPS同源基因的表达特性，结果表明SPS1基因在源组织中表达量高，SPS2、SPS6和SPS8基因在源、库组织中的表达量相同，SPS1、SPS2、SPS6、SPS8和SPS11基因的差异表达决定了水稻在各生长时期的发育特征。王丽娟等[16]研究了枸杞SPS基因在不同组织中的表达规律，结果表明该基因在花和果实中具有较高的表达量，而在叶和根中的表达量较低。肖小虎等[28]分析了巴西橡胶SPS基因的表达模式，结果表明该基因在胶乳中的表达量最高，而在树皮、叶片、根、花、种子等的表达量较低。李付鹏等[29]分析了可可TcSPS1、TcSPS2、TcSPS3、TcSPS4等4个基因的表达模式，发现TcSPS1和TcSPS2表达模式类似，在果实中表达量为最高，其次为树皮，在叶片中的表达量最低，TcSPS3和TcSPS4的表达模式类似，在叶片中表达量为最高，其次为树皮，在花蕾中的表达量最低。本研究采用实时荧光定量PCR技术分析了MeSPS在各时期、各组织中的表达量，结果显示在各生长时期，MeSPS在叶片中的表达量均高于茎段和块根，这与水稻[27]SPS1基因的表达模式相类似；该基因在苗期叶片和茎段中的表达量比其他时期高，呈先下降后上升的趋势，在块根中表达量最高的时期出现在块根膨大期，先下降后上升再下降的趋势，这一结果进一步验证了植物SPS基因在不同组织中表达的差异性。
蔗糖代谢在植物生长发育过程中起着十分重要的作用，本研究首次成功克隆木薯蔗糖代谢关键酶基因(MeSPS)，该基因全长cDNA序列为3 857 bp，ORF长3 228 bp，编码一个含1 076个氨基酸，具有真核生物典型的poly (A)尾。采用qPCR技术发现了MeSPS基因在木薯苗期的表达量较高，且同一生长时期在叶片中的表达量高于其他组织，说明该基因参与叶片光合产物的合成代谢，这与木薯块根淀粉积累机制有何联系有待进一步研究。
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图 1 化合物1-17的分离流程
Figure 1. Flow diagram on separating chemicals in n-butanol extract of A.altissima leaves and branches
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图 3 化合物2、7和11对TMV侵染的治疗效应
a：化合物2 的治疗作用；b：化合物7的治疗作用；c：化合物11的治疗作用。
Figure 3. Curative effects of Compounds 2, 7, and 11 against TMV infection
a: Curative effect of Compound 2; b: Curative effect of Compound 7; c: Curative effect of Compound 11;
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图 4 化合物6、13和14对TMV侵染的钝化作用
a化合物6 的钝化作用；b化合物13 的钝化作用；c化合物14的钝化作用
Figure 4. TMV-inactivation effects of Compounds 6, 13, and 14
a: TMV-inactivation effect of Compound 6; b: inactivation effect of Compound 13; c: inactivation effect of compound 14.
表 1 化合物1～17对TMV的保护作用
Table 1 Anti-TMV effects of 17 compounds
化合物
Compound处理平均
枯斑数
Local lesions of
treatment对照平均
枯斑数
Local lesions of
controlP值
P value抑制率
Inhibition
rate/%1 18.33±5.51 24.00±7.55 0.35 23.42±1.63 g 2 16.33±8.02 24.67±12.01 0.37 34.25±4.71 cd 3 12.33±4.04 14.33±5.03 0.62 13.41±2.34 h 4 13.33±4.04 21.00±7.21 0.18 35.65±4.35 bc 5 17.67±6.51 23.00±7.55 0.41 23.89±3.47 g 6 14.33±7.09 22.00±12.12 0.40 33.14±5.19 cd 7 19.67±4.04 29.00±5.57 0.07 32.30±0.96 de 8 22.00±7.00 29.33±9.87 0.35 24.56±2.16 fg 9 12.67±7.37 17.67±10.02 0.52 28.72±1.21 ef 10 14.67±6.51 24.33±11.06 0.26 39.77±4.36 b 11 15.67±7.02 25.00±11.53 0.30 37.02±1.14 bc 12 27.33±14.74 31.00±15.87 0.78 12.66±2.85 h 13 20.33±5.03 31.00±9.17 0.16 33.80±5.78 cd 14 12.33±4.16 19.00±4.58 0.14 36.02±5.96 bc 15 11.33±5.69 15.67±6.66 0.44 29.69±8.90 de 16 11.00±3.00 15.00±4.00 0.24 26.75±0.48 ef 17 13.00±6.00 18.33±9.50 0.46 27.38±4.97 ef 宁南霉素
（Ningnanmycin）3.67±1.73 8.33±3.79 0.02 55.19±1.30 a 数据为3次重复取平均值；化合物质量浓度为50 μg·mL−1；不同字母表示在5%水平显著，下同。
Data are averages of triplicate; mass concentration at 50 μg·mL−1; data with different letters indicate significance at 5% level.Same for below.
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表 2 化合物1～17对TMV的治疗作用
Table 2 Anti-TMV effects of 17 compounds on infected tissue
化合物
Compound处理平均
枯斑数
Local lesions of
treatment对照平均
枯斑数
Local lesions of
control
抑制率
Inhibition
rate/%1 17.33±4.73 22.67±5.86 23.74±1.41 f 2 16.67±8.33 31.00±15.13 46.45±0.81 b 3 16.00±6.83 22.25±10.40 27.06±3.33 f 4 13.33±6.81 17.67±8.33 25.39±2.76 f 5 13.33±4.04 17.67±5.13 24.68±1.82 f 6 17.67±6.51 24.00±8.54 26.56±1.50 f 7 23.33±6.35 34.33±10.02 31.70±3.56 ef 8 19.00±3.00 26.67±5.03 28.48±2.40 f 9 14.00±6.56 21.33±10.07 34.24±0.84 de 10 26.33±4.51 41.67±8.62 36.50±2.35 d 11 18.67±3.79 33.33±7.57 43.81±1.26 c 12 16.50±5.26 31.50±10.41 47.11±4.21 b 13 23.00±4.00 28.67±5.69 19.50±4.18 g 14 14.33±8.02 19.00±11.00 24.24±2.88 f 15 26.00±7.55 36.33±10.50 28.38±1.92 f 16 12.67± 5.51 15.33±6.66 17.41±0.76 g 17 10.33± 4.16 14.00±6.25 25.26±3.18 f 宁南霉素
（ningnanmycin）16.00± 2.00 34.33±6.51 53.01±3.05 a
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表 3 化合物1-17对TMV的钝化作用
Table 3 TMV inactivation effects of 17 compounds
化合物
Compound处理平均
枯斑数
Local lesions of
treatment对照平均
枯斑数
Local lesions of
controlP值
P
value抑制率
Inhibition
rate/%1 12.33±3.51 27.67±6.43 0.02 55.72±4.61 b 2 21.33±3.79 29.00±6.08 0.13 26.04±2.9 ef 3 14.67±3.51 22.00±7.00 0.18 32.14±5.64 de 4 9.33±4.51 15.00±7.55 0.32 37.45±1.71 cd 5 13.67±7.51 20.67±12.01 0.44 33.23±3.18 de 6 10.33±3.51 28.33±7.51 0.02 64.02±2.79 a 7 22.00±6.25 40.33±9.29 0.04 45.86±3.64 c 8 22.33±5.69 53.00±13.53 0.02 57.87±2.01 ab 9 19.00±2.00 30.00±4.36 0.02 36.33±4.31 cd 10 24.67±8.33 42.00±10.82 0.09 42.03±4.42 c 11 14.67±3.21 26.33±5.51 0.03 44.39±0.92 c 12 26.33±10.02 40.00±16.52 0.28 33.65±3.05 de 13 9.00±1.00 26.00±3.61 0.001 65.18±3.79 a 14 16.33±3.21 45.33±6.81 0.002 63.40±9.21 ab 15 25.67±1.53 31.67±3.06 0.03 18.74±3.61 f 16 27.00±8.19 43.67±15.04 0.16 37.55±3.32 cd 17 20.00±3.61 30.67±5.51 0.04 34.77±2.47 cd 宁南霉素
（ningnanmycin）5.67±1.53 15.00±1.53 0.07 61.72±1.98 ab
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