Flow Cytometric Determination on Genome Size of Ardisia crenata Germplasms
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摘要:目的 基于流式细胞术初步探索测定朱砂根基因组大小的方法和流程，为朱砂根基因组文库的建立、基因组全序列测定及其基因组学研究等工作的开展提供基础数据。方法 以24份朱砂根（Ardisia crenata）种质资源为供试材料，包括22个人工选育品种和2个野生种质资源，并以番茄（Lycopersicon esculentum）作为内参样本，利用流式细胞术对朱砂根基因组大小进行测定。结果 24份朱砂根基因组大小（C值）为1.77～2.41 Gb，平均大小1.87 Gb；其中玛瑙红（Z-17）、霞珠（Z-20）、珠塔（Z-22） C值最小，均为1.77 Gb，赤丹 C最大，为2.41Gb，部分品种间基因组大小存在一定程度的差异。结论 首次测定朱砂根种质资源的基因组大小，其研究结果可为朱砂根基因组文库的建立、基因组全序列测定及其基因组学研究等工作的开展提供基础数据。Abstract:Objective Genome sizes of the economically, medicinally, and ornamentally valuable Ardisia crenata were determined using flow cytometry.Methods Genome sizes of 22 selectively bred cultivars and two wild A. crenata germplasms, along with Lycopersicon esculentum as internal reference, were determined by flow cytometry.Results The sizes ranged from 1.77 Gb to 2.41 Gb averaging 1.87 Gb with the smallest C-value of 1.77 Gb found on Agate Red (Z-17), Kasumi Pearl (Z-20), and Zhu Ta (Z-22), while the largest of 2.41 Gb on Chidan. Variations existed among the germplasms.Conclusion For the first time, the genome sizes of various A. crenata were determined to be available for library construction and genomics studies on the valuable natural resource.
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Keywords:
- Ardisia crenata /
- flow cytometry /
- genome size /
- germplasms
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0. 引言
【研究意义】银耳（Tremella fuciformis Berk），是银耳科、银耳属的一种食药兼用真菌，又名雪耳、银耳子、白木耳[1]。银耳主要栽培于我国和部分亚洲地区，因具有抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫力等多种保健功效深受消费者青睐[2-4]。由于银耳鲜样含水量高且营养丰富，不利于贮藏保鲜，大部分的银耳是以脱水干制品的形式销售[4]，因此，研究银耳干制工艺对银耳产业的发展具有积极的意义。【前人研究进展】农产品脱水干制过程的温度等参数会直接影响干制品的外观和营养品质[5]。陈锦屏等[6-7]研究表明，升温速度过快的烘干方式会导致红枣中总糖、维生素C等营养成分的含量急剧降低，而呋喃甲醛等危害物质的含量随着烘干温度的升高而逐渐增加。冷冻干燥枣粉的还原糖和总糖含量高于热风干燥组[8]。晾干处理的普洱茶比晒干或烘干处理的普洱茶鉴定分离出更多的香气化合物，其含量也有所差异[9]。关于银耳脱水干制的研究主要集中在热风干燥、真空干燥等工艺参数优化和烘干工艺对收缩率、复水比、组织结构等产品品质的影响[5, 10]。另有学者利用数学模型预测了银耳干燥过程含水量的变化[11]。针对干制过程银耳营养品质变化的研究尚不多见，仅李亚欢等[4]报道了热风干燥等3种干燥方式对银耳蛋白质、总糖等的影响，但研究涉及的干燥方式与银耳实际生产中大规模干制方法有所不同。【本研究切入点】福建省古田县是我国银耳重点产区，银耳产量占全国80%，多采用热风烘干进行干制[5]，银耳干品中二氧化硫残留是否超标成为消费者关注重点。目前，古田银耳烘干的热源主要有银耳栽培的废菌包、木屑及电，模式主要有工厂化、小灶。不同模式下银耳的营养变化不明确。【拟解决的关键问题】本研究探讨古田县常见的4种银耳干制生产模式（以银耳废菌棒为燃料工厂化烘干、以废菌棒木屑为燃料工厂化烘干、以银耳废菌棒为燃料小灶烘干、电热工厂化烘干）对银耳中蛋白质、总糖、还原糖、二氧化硫残留的影响，重点评价4种方式下银耳氨基酸的营养，旨在为银耳烘干模式的选择优化提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜银耳：我国银耳主栽品种之一Tr01，福建古田县建宏农业开发有限公司提供。采集目前古田县银耳干制的4种主要方式制备的银耳干品：燃料废菌棒工厂化烘干（M1）、燃料废菌棒木屑工厂化烘干（M2）、燃料废菌棒小灶烘干（M3）、电热工厂化烘干（M4）。每种方式的烘干样品均源自3个烘干厂，并都包括烘干前清洗浸泡、未清洗浸泡两种处理[12]，每个处理均采集2批次样品，共计48份样品。混合氨基酸标准品购自美国sigma公司；盐酸（优级纯）、硫酸等其余试剂为分析纯，均购自西陇化工；试验用水为去离子水，电导率小于1 S·m−1。
1.2 品质指标测定
1.2.1 基础营养指标测定
蛋白质含量测定参考GB5009.5—2016[13]，总糖含量测定参考GB 5009.8—2016[14]，还原糖含量测定参考GB 5009.7—2016[15]，二氧化硫含量测定参考GB 5009.34—2016[16]。
1.2.2 氨基酸组成分析
称取0.1 g左右已磨碎的银耳粉末样品，置于5 mL安瓿瓶，加入3 mL盐酸（6 mol·L−1），抽真空后，置于110 ℃烘箱中水解22 h。冷却后，移入50 mL容量瓶，定容。取适量水解液，蒸干，溶解于1 mL pH2.2的缓冲液，利用L-8800型氨基酸自动分析仪（日本HITACHI公司）测定17种氨基酸含量。
1.2.3 氨基酸营养评价
分析各组银耳必需氨基酸、呈味氨基酸、不同构型氨基酸和风味氨基酸组成特征。利用FAO/WHO建议的氨基酸评分标准模式评价银耳氨基酸营养，分别按照公式（1）～（3）计算氨基酸比值（RAA）、氨基酸比值系数（RC）、氨基酸比值系数分（SRC）。
RAA(%)=wxws×100 (1) wx：样品中每克氮的氨基酸含量，mg·g−1；ws：参比蛋白中每克氮的氨基酸含量，mg·g−1。
RC=氨基酸比值/氨基酸比值之均数 (2) 当样品氨基酸组成与推荐的氨基酸模式完全一致时，各氨基酸的RC均应等于1。RC＞1，表示该氨基酸含量相对过剩，反之则表示相对不足。RC最小的氨基酸为第一限制氨基酸。
SRC=100−(CV×100) (3) 式中，CV是RC的变异系数。SRC越接近100，其营养价值相对较高。SRC越小，食物氨基酸营养价值越差。
1.3 数据处理
数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示。利用SPSS 17.0统计学软件进行组间差异性分析，其中浸泡与未浸泡组间通过独立样本t检验（t-Test）比较平均值差异、4个烘干工艺组间通过单因素方差分析（One-Way ANOVA）Duncan’s多重比较差异，P＜0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 浸泡和烘干工艺对银耳基本营养的影响
鲜银耳烘干前，常采用清洗、浸泡两道工序，待吸足水分后，再进行烘干，以使银耳干品朵形更为舒展、美观。但丑耳烘干前未经清洗、浸泡。烘干前的浸泡工序对银耳蛋白质（Pr）、总糖（TS）、还原糖（RS）、氨基酸营养和二氧化硫含量无显著性影响（P＞0.05）（图1）。经测定，4种烘干模式的银耳二氧化硫含量均低于方法定量限（10 mg·kg−1）。不同烘干工艺比较发现（图1），相同烘干模式下有无浸泡对银耳总糖、还原糖、蛋白质的含量无显著性影响（P＞0.05）。但浸泡后M2、M3烘干方式的银耳总糖、还原糖、蛋白质含量显著高于M4（P＜0.05）。未浸泡的银耳在M2、M3烘干方式下的总糖、还原糖含量显著高于M4（P＜0.05），但蛋白质含量无显著性差异（P＞0.05）。可知，在同种烘干模式下，浸泡并不会造成银耳中部分基础营养成分的显著性流失，但烘干模式对银耳营养有所影响。经浸泡的银耳在燃料废菌棒木屑工厂化烘干和燃料废菌棒小灶烘干方式下总糖、还原糖、蛋白质均损失较少，而未浸泡的银耳在上述两种烘干方式下，仅总糖和还原糖损失较少，蛋白质没有显著差异。
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图 1 烘干工艺对银耳部分营养指标的影响注：图中不同小写字母表示同一前处理方式下不同烘干工艺之间差异显著（P＜0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P＞0.05）。Figure 1. Effects of drying technology on nutritional indices of T. fuciformisNote: Data with different letters indicate significant difference at 0.05 level.2.2 烘干工艺对银耳氨基酸组成的影响
2.2.1 氨基酸含量
因未浸泡组银耳在不同烘干模式下蛋白质含量未有显著性差异（P＞0.05），故本文仅考察浸泡组银耳的氨基酸营养变化，如表1所示。4种模式烘干的银耳均至少含17种蛋白质类氨基酸，总量介于6.04～6.34 g·hg−1。谷氨酸含量最高，其次为天冬氨酸（部分可能是天冬酰胺水解时释放）、亮氨酸，胱氨酸含量最低。必需氨基酸、儿童必需氨基酸、呈味类氨基酸的总量分别介于2.20～2.31 g·hg−1、0.48～0.56 g·hg−1、2.98～3.11 g·hg−1。但统计学结果表明，4组银耳在单种氨基酸、必需氨基酸总量、儿童必需氨基酸、呈味类氨基酸含量上并无显著性差异（P＞0.05）。
表 1 不同烘干工艺下银耳的氨基酸组成Table 1. Amino acid composition of T. fuciformis dehydrated by different drying technologies单位：g·hg−1 氨基酸
Amino acidM1 M2 M3 M4 氨基酸
Amino acidM1 M2 M3 M4 天冬氨酸（Asp）△ 0.70±0.03 0.70±0.06 0.69±0.01 0.68±0.04 蛋氨酸（Met）* 0.19±0.02 0.18±0.02 0.19±0.01 0.17±0.03 丝氨酸（Ser）△ 0.41±0.01 0.40±0.03 0.40±0.01 0.39±0.02 赖氨酸（Lys）* 0.34±0.01 0.34±0.02 0.34±0.01 0.33±0.02 谷氨酸（Glu）△ 0.91±0.02 0.84±0.09 0.92±0.02 0.87±0.11 异亮氨酸（Ile）* 0.26±0.01 0.25±0.02 0.26±0.01 0.24±0.02 甘氨酸（Gly）△ 0.37±0.01 0.37±0.03 0.37±0.00 0.36±0.02 亮氨酸（Leu）* 0.46±0.02 0.45±0.02 0.45±0.01 0.45±0.02 丙氨酸（Ala）△ 0.40±0.02 0.40±0.02 0.40±0.01 0.38±0.02 苯丙氨酸（Phe）* 0.31±0.01 0.31±0.01 0.30±0.01 0.30±0.01 脯氨酸（Pro）△ 0.32±0.01 0.30±0.02 0.31±0.00 0.30±0.02 合计TAA 6.32±0.16 6.21±0.50 6.34±0.02 6.04±0.41 酪氨酸（Tyr） 0.28±0.03 0.33±0.05 0.32±0.04 0.29±0.04 必需氨基酸总量 TEAA 2.31±0.08 2.26±0.09 2.27±0.07 2.20±0.05 胱氨酸（Cys） 0.10±0.00 0.10±0.02 0.11±0.01 0.10±0.00 呈味氨基酸总量 TFAA 3.11±0.10 3.01±0.08 3.09±0.09 2.98±0.09 组氨酸（His）※ 0.14±0.01 0.14±0.01 0.14±0.00 0.14±0.01 TEAA/TAA（%） 36.55 37.39 35.80 36.42 精氨酸（Arg）※ 0.38±0.02 0.37±0.06 0.42±0.01 0.34±0.06 TFAA/TAA（%） 49.21 48.47 48.74 49.34 苏氨酸（Thr）* 0.39±0.01 0.38±0.02 0.38±0.01 0.37±0.02 TEAA/TNEAA（%） 57.60 58.78 55.76 57.28 缬氨酸（Val）* 0.36±0.01 0.35±0.02 0.35±0.00 0.34±0.02 注：*必需氨基酸；※儿童必需氨基酸；△呈味氨基酸；TAA氨基酸总量；TEAA必需氨基酸总量；TNEAA非必需氨基酸总量。
Note: * essential amino acid; ※ essential amino acids for children; △ flavor amino acids; TAA, total amino acid; TEAA, total essential amino acid; TNEAA, total non-essential amino acid.2.2.2 氨基酸组成
氨基酸分子结构及其包含的元素与其营养密切相关，如含硫氨基酸（蛋氨酸、胱氨酸）与动物营养、免疫相关，支链氨基酸也具有增强免疫力、调节代谢等营养生理作用[17]。银耳中支链氨基酸含量远高于芳香族氨基酸和含硫氨基酸（表2），但其支链氨基酸/芳香族氨基酸比值仅为1.64～1.79，低于草菇、长根菇等[18-19]。在风味氨基酸含量方面，银耳中的苦味类氨基酸＞甜味类氨基酸＞酸味类氨基酸（表3）。但4组银耳3类构型氨基酸和3类风味氨基酸含量并无显著性差异（P＞0.05）。
表 2 烘干工艺对银耳中不同构型氨基酸组成的影响比较Table 2. Effects of drying technology on content of amino acids of different structures in T. fuciformis类型
TypesM1 M2 M3 M4 含量
Content/（g·hg−1）比例
Proportion/%含量
Content/（g·hg−1）比例
Proportion/%含量
Content/（g·hg−1）比例
Proportion/%含量
Content/（g·hg−1）比例
Proportion/%含硫氨基酸 SAA 0.29±0.02 4.59 0.28±0.02 4.51 0.30±0.01 4.73 0.27±0.03 4.47 支链氨基酸 BCAA 1.06±0.00 16.77 1.05±0.02 16.91 1.06±0.01 16.72 1.03±0.02 17.05 芳香族氨基酸 AAA 0.59±0.01 9.34 0.64±0.01 10.30 0.62±0.01 9.78 0.59±0.02 9.77 BCAA/AAA 1.79 1.64 1.71 1.74 注：含硫氨基酸包括半胱氨酸、甲硫氨酸；支链氨基酸包括缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸。
Note: Sulfur-containing amino acids include Cys and Met; branched chain amino acids include Val, Ile, and Leu; aromatic amino acids include Phe and Tyr.表 3 烘干工艺对银耳中风味氨基酸的影响Table 3. Effects of drying technology on amino acids of different tastes in T. fuciformis类型
TypesM1 M2 M3 M4 含量
Content/（g·hg−1）比例
Proportion/%含量
Content/（g·hg−1）比例
Proportion/%含量
Content/（g·hg−1）比例
Proportion/%含量
Content/（g·hg−1）比例
Proportion/%甜味类 Sweet 1.89±0.04 29.90 1.85±0.07 29.79 1.86±0.06 29.34 1.80±0.04 29.80 苦味类 Bitter 2.10±0.05 33.23 2.05±0.07 33.01 2.11±0.05 33.28 1.98±0.06 32.78 酸味类 Sour 1.61±0.03 25.47 1.54±0.08 24.80 1.61±0.02 25.39 1.55±0.09 25.66 注：甜味类氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丝氨酸；苦味类氨基酸包括异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、组氨酸、精氨酸；酸味类氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸。
Note: Amino acids with sweet taste include Gly, Ala, Thr, Pro, and Ser; amino acids with bitter taste include Ile, Leu, Met, Phe, Val, His, and Arg; amino acids with sour taste include Asp and Glu.2.3 烘干工艺对银耳氨基酸营养的影响
参照FAO/WHO推荐的蛋白模式对银耳必需氨基酸营养进行评价，结果如表4示。除苏氨酸（Thr）外，银耳必需氨基酸含量均低于鸡蛋蛋白模式中相应的氨基酸含量。与FAO/WHO建议的参考蛋白相比，银耳具有较高的苏氨酸（Thr）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）含量。从表5可见，银耳中的含硫氨基酸、Phe、Tyr、Thr含量相对丰余，而其余4种必需氨基酸含量相对不足，其中Lys为第一限制性氨基酸。烘干模式对银耳氨基酸营养的平衡性略有影响，SRC值从高到低依次为M1＞M4＞M3＞M2，介于77～81，说明银耳是一种氨基酸营养比较均衡的食物。
表 4 不同烘干工艺制备的银耳氨基酸营养评价Table 4. Effects of drying technology on protein nutrition of T. fuciformis必需氨基酸 EAA 烘干方式 Drying methods 蛋 Egg FAO/WHO M1 M2 M3 M4 M1 M2 M3 M4 RAA/% RC RAA/% RC RAA/% RC RAA/% RC Ile 211 203 211 195 331 250 84.40 0.87 81.20 0.82 84.40 0.87 78.00 0.79 Leu 373 365 365 365 534 440 84.77 0.88 82.95 0.84 82.95 0.86 82.95 0.84 Lys 276 276 276 268 441 340 81.18 0.84 81.18 0.82 81.17 0.84 78.82 0.79 Met+Cys 235 227 244 219 386 220 106.81 1.44 103.18 1.05 110.90 1.15 99.54 1.01 Phe+Tyr 479 519 503 479 565 380 126.05 1.31 136.58 1.38 132.36 1.37 126.05 1.28 Thr 317 308 308 300 292 250 126.80 1.31 123.20 1.25 123.20 1.28 120.00 1.22 Val 292 284 284 276 411 310 94.19 0.98 91.61 0.93 91.61 0.95 89.03 0.90 表 5 不同烘干方式银耳限制性氨基酸排序Table 5. Rank on contents of restrict amino acids in T. fuciformis烘干工艺
Drying methods限制氨基酸 The restrict amino acid SRC 1 2 3 4 M1 Lys Ile Leu Val 80.52 M2 Lys Ile Leu Val 77.80 M3 Lys Leu Ile Val 79.15 M4 Lys Ile Leu Val 79.55 3. 讨论与结论
干燥是农产品加工业中常见的加工单元，能有效降低产品水分含量，阻碍腐败微生物滋生，延长产品保质期。但干燥方式可直接影响农产品内部结构被破坏及细胞收缩的程度[20]。黄建立等[5]研究发现，银耳加工的重要生产环节的干制对银耳品质形成有重要影响。因此，合理的脱水干制工艺应在尽量不影响食物营养品质的同时，又可有效延长其贮藏期。温度是干燥方式的重要参数之一，温度越低，样品内部结构或组织细胞受损越小，营养成分保持度越好[4]。研究表明，在冷冻干燥的干制条件下样品的水分、糖类、蛋白质含量和干制品的感官质量变化较小[4, 21-22]。然而，冷冻干燥设备投资成本和运转费用高，产量小，不利于在银耳实际生产中大规模推广应用。此外，冷冻干燥使物料中的冰晶直接升华并留下大量空穴，产品结构疏松，运输和包装过程中易形成粉末[23]。与之相比，工艺简单、成本较低的热风干燥仍是银耳大规模干制的主要方法，但可能存在干燥温度高、水分扩散速度缓慢、时间长、产品组织易断裂和塌陷，糖类物质易焦化、分解，加剧美拉德反应，导致干制品中总糖含量降低等不足。因此，热风干燥的工艺需要逐步优化，减少烘干过程营养物质的流失。本研究考察的银耳干制实践中不同燃料及烘干设备差异对银耳干品营养影响，与新鲜的银耳[24]相比，热烘干制备的银耳干品单一氨基酸含量、氨基酸营养均衡性等方面有所变化。这与顾可飞等[25]开展的烘干前后羊肚菌营养变化情况较为一致。分析认为，不同氨基酸的热稳定差异或美拉德反应与食用菌烘干前后营养变化密切相关，但确切机理待进一步研究。在烘干厂的规模上有规模化工厂和小灶作坊之分，前者尤其是电热工厂化烘干在升温程序、温度波动等参数控制方面更为精准。但本研究中电热烘干银耳的糖类、蛋白含量显著低于其他组，且氨基酸含量也低于燃料废菌棒工厂化烘干。可见，银耳电热烘干的生产工艺及参数控制仍有待进一步完善。在市场普遍关注的食用菌干品质量安全指标二氧化硫残留上，4种模式制备的银耳干品二氧化硫残留水平均低于方法检测限，表明市场抽检发现的银耳二氧化硫残留样品应源自非法添加或其他燃料烘干所致。
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图 1 流式细胞仪检测24份朱砂根荧光峰值
荧光峰值直方图左侧峰代表内参番茄，右侧峰代表朱砂根种质；FL2-H:荧光脉冲高度。
Figure 1. Fluorescence peak histogram of 24 A. crenata detected by flow cytometry
Left peak on fluorescence histogram represents internal reference L. esculentum; right peak, A. crenata varieties.FL2-H:Fluore scence pulse height.
表 1 24份朱砂根供试材料采样信息
Table 1 Sampling of 24 A. crenata germplasms
编号 No. 种质名称 Germplasm name 种质类别 Germplasm type 编号 No. 种质名称 Germplasm name 种质类别 Germplasm type Z-01 赤丹 Chi Dan 栽培品种 Cultivated variety Z-13 福株 Fu Zhu 栽培品种 Cultivated variety Z-02 锦绣 Jin Xiu 栽培品种 Cultivated variety Z-14 金边富贵 Jin Bian Fu Gui 栽培品种 Cultivated variety Z-03 绿翡翠 Green Jade 栽培品种 Cultivated variety Z-15 金玉满堂 Jin Yu Man Tang 栽培品种 Cultivated variety Z-04 粉佳人 Pink Beauty 栽培品种 Cultivated variety Z-16 竹叶富贵 Bamboo Leaf Fu Gui 栽培品种 Cultivated variety Z-05 平安富贵 Ping An Fu Gui 栽培品种 Cultivated variety Z-17 玛瑙红 Onyx Red 栽培品种 Cultivated variety Z-06 金冠 Golden Crown 栽培品种 Cultivated variety Z-18 碧珠 Bi Zhu 栽培品种 Cultivated variety Z-07 福满堂 Fu Man Tang 栽培品种 Cultivated variety Z-19 龙珠 Long Zhu 栽培品种 Cultivated variety Z-08 碧霞珠 Bixia Zhu 栽培品种 Cultivated variety Z-20 霞珠 Xia Zhu 栽培品种 Cultivated variety Z-09 金富贵 Jin Fu Gui 栽培品种 Cultivated variety Z-21 仙桃 Xian Tao 栽培品种 Cultivated variety Z-10 梁野富贵 Liang Ye Fu Gui 栽培品种 Cultivated variety Z-22 珠塔 Zhu Ta 栽培品种 Cultivated variety Z-11 赤玲珑 Red Lingerie 栽培品种 Cultivated variety Z-(A) 朱砂根A A. crenata A 野生种质 Wild germplasm Z-12 大富贵 Da Fu Gui 栽培品种 Cultivated variety Z-(B) 朱砂根B A. crenata B 野生种质 Wild germplasm 
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表 2 流式细胞术测定的24份朱砂根品种资源基因组大小
Table 2 Genome sizes of 24 A. crenata determined by flow cytometry
样品编号Sample No. 内参荧光强度Internal reference fluorescence intensity 待测样品荧光强度Fluorescence intensity of the sample to be measured 比值Ratio 基因组大小Genome/Gb 样品编号Sample No. 内参荧光强度Internal reference fluorescence intensity 待测样品荧光强度Fluorescence intensity of the sample to be measured 比值Ratio 基因组大小Genome/Gb Z-01 18.90 51.79 2.74 2.41 Z-13 26.61 63.08 2.37 2.09 Z-02 23.83 48.40 2.03 1.79 Z-14 27.09 65.13 2.40 2.12 Z-03 24.33 49.58 2.04 1.79 Z-15 27.22 64.87 2.38 2.10 Z-04 26.06 55.25 2.12 1.87 Z-16 26.68 55.70 2.09 1.84 Z-05 18.75 48.60 2.59 2.28 Z-17 26.63 53.53 2.01 1.77 Z-06 21.30 52.18 2.45 2.16 Z-18 27.19 55.46 2.04 1.79 Z-07 22.72 56.47 2.49 2.19 Z-19 27.61 55.73 2.02 1.78 Z-08 22.44 55.92 2.49 2.19 Z-20 28.26 56.70 2.01 1.77 Z-09 24.16 51.55 2.13 1.88 Z-21 28.56 58.22 2.04 1.79 Z-10 26.36 55.40 2.10 1.85 Z-22 28.34 56.89 2.01 1.77 Z-11 26.07 59.64 2.29 2.01 Z-(A) 28.77 58.62 2.04 1.79 Z-12 25.35 51.83 2.04 1.80 Z-(B) 28.54 58.29 2.04 1.80
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