Effects of Disinfection Treatments on Fungal Community in Rhizosphere Soil of Lilium ‘Conca d'Or’
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摘要:目的 通过土壤理化消毒处理，抑制有害菌落的滋长，改善百合生长期间根际土壤真菌群落生态，为解决百合连作障碍提供理论依据。方法 以百合根际土壤为试验材料，应用热水、棉隆和乙醇进行土壤预处理，基于llumina MiSeq测序平台，研究百合重茬地的根际土壤真菌群落结构和丰度的变化趋势。结果 热水处理对幼苗期百合的生长最优，棉隆处理对生长起延缓作用。从 4 份土壤样本中获得472440 条 ITS 序列，在 97%序列相似性基础上可划分为 410个可操作分类单元（OTU）。不同处理的真菌种类和相对丰度随着百合生长发育过程呈现不同变化规律，子囊菌门均为最优势菌群，热水和棉隆处理对病原菌（根腐菌和青霉菌）效果最为明显。丰度聚类分析结果，3个发育阶段过程中优势菌群变化较大，群落结构与CK差异显著。结论 热水和棉隆处理均能有效改善百合根际土壤真菌群落结构，棉隆属于一种土壤化学处理高效途径，处理后菌群变化较大，前期抑制强，应在处理土壤后増施有益菌，可获得理想应用效果。Abstract:Objective Physical and chemical means of disinfection were applied on soil to determine the effects on the fungal community in the rhizosphere as well as the growth of Lilium ‘Conca d'Or’ under continuous cropping.Methods The rhizosphere soil was disinfected with hot water, dazomet, or alcohol. Illumina Miseq sequencing was employed to determine the structure and abundance of the rhizosphere fungal community before and after the treatments. Effect of the treatments on the growth of Lilium seedlings was observed.Result The hot water treatment was best for the growth of Lilium seedlings, while dazomet delayed it. A total of 472,440 ITS sequences were obtained from the 3 treatment and one control samples. They were divided into 410 operational taxa (OTUs) at a 97% similarity. The species and relative abundance of fungi in the soils varied among the samples and changed during the growth and development of the plants. Ascomycete was the most dominant flora in all samples. Both treatments of hot water and dazomet exerted the most significant effects on pathogens such as root fungus and penicillium. As indicated by the abundance cluster analysis, flora dominance altered significantly in 3 development stages, and the community structure in the treatment soils differed significantly from control.Conclusion Disinfection by either hot water or dazomet could effectively improve the fungal community structure in the Lilium rhizosphere soil. Dazomet was an effective chemical disinfectant which significantly inhibited fungal growth in general at the early stage after the application. Therefore, to maximize the desired final result it was highly recommended that beneficial bacteria be added following the disinfecting treatment.
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0. 引言
【研究意义】根际微生物种类众多，是连结植物根系与土壤的狭窄区域，是影响许多生物生长的活跃界面，也是地球上最复杂的生态系统之一[1]。根际的生物种类主要包括细菌、真菌、卵菌、线虫、原生动物、藻类、病毒、古细菌和节肢动物[2-3]。根际生物主要分为两个类群：其中一类与植物健康生长有关，主要是固氮菌、菌根真菌、促生菌、生防菌、真菌；另一类是不利于植物健康生长的根际生物，包括病原真菌、卵菌和细菌[4]。此外，土壤真菌在土壤养分循环与陆地生态系统中起着至关重要的作用[5]。一方面，植物的丰富度和植被盖度直接影响了土壤真菌和真菌对土壤养分的吸收[6]，另一方面土壤性状，包括土壤理化性质、土壤营养成分和一些微量元素，有利于土壤以真菌为主的网状结构形成，即土壤真菌群落[7]。单一栽培品种在农业生态系统中对真菌多样性的影响是一个普遍现象[8-9]，连续种植的百合容易引起土壤真菌病害的发生[10]。百合通常3年种植才收获或常年种植切花，容易产生土传病害。已经报道的百合真菌性病害有22种[11]，主要是枯萎病、灰霉病、叶枯病、根腐病，其中枯萎病属真菌性的土传病害，由尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌侵染引起，对百合植株的危害十分严重，很大程度影响了百合切花的质量和产量[12]。因此通过土壤消毒方式，改变百合土壤真菌群落生态，从而防治百合真菌病害，具有重要意义。【前人研究进展】近年来，高通量测序技术已应用于土壤根际微生物的多样性研究。研究学者以植物种质根际细菌群落的分布以确定核心微生物的组成，通过焦磷酸测序16S rRNA分析土壤根际和内生根室的细菌片段，获得土壤不同类型的群落[13]。2010年Bates等[14]选取146份土壤样本，筛选出一套通用的引物几乎区分开所有的细菌和古生菌类群。1990年White等[15]通过PCR方法扩增真菌的ITS序列进行聚类分析。利用非化学手段处理作物土壤以降低真菌病害，已有相关报道。El-Gali等[16]对扁豆苗圃苗床土壤以热水消毒，土壤的尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和腐霉的繁殖体大大减少；张春怡[17]等采用熏蒸材料土壤消毒结合微生物菌剂处理，高通量测序显示能显著降低根际真菌Ace、Chao和Shannon指数，茄子黄萎病得到有效防控；胡洪涛等[18]采用棉隆消毒土壤，对甘蓝根肿病的防效达91.56%，高通量测序结果有15个属的真菌丰度发生显著改变。【本研究切入点】采用高通量测序技术，探讨土壤不同消毒方式对百合根际真菌群落的影响，筛选出抑制百合有害真菌病原且提高有益真菌的方法，尚待深入研究。【拟解决的关键问题】本研究以福建南平延平百合基地根际土壤为研究对象，采用Illumina Miseq高通量测序技术对真菌V3~V5区和ITS1区片段进行测序，对根际土壤的真菌群落多样性分析，结合田间棉隆、热水和乙醇处理对应的效果，获得有效解决百合连作问题的物理或化学途径，并从分子水平揭示百合根际土壤真菌群落的多样性和滋生特点，以期为百合根际土壤真菌的良性生态构建提供一定的理论参考。
1. 材料与方法
1.1 试验地概况
试验位于福建省南平市延平区王台镇罗源村南平市兴一春百合园艺有限公司百合基地，属中亚热带海洋季风气候，年均气温17.3 ℃，年降水量1669 mm。试验地土壤类型为红壤，0～10 cm土层的基本理化性质：pH 5.2，有机质15.3 g·kg−1，碱解氮66.1 mg·kg−1，速效磷54.2 mg·kg−1，速效钾269 mg·kg−1，全氮 800 mg·kg-1，全磷 450 mg·kg-1，全钾 39.9 g·kg-1。
1.2 试验设计
试验地百合种球均经过夏季采收后（5～7月）长达2个月的传统漫灌淹浸过程，排水晾干，于2019年12月11日开始种植（种植时间安排依据南平地区农户每年百合种球切花种植时间）。选取常年种植百合品种木门（ConcaD’or）的地块，设置4个处理：①棉隆处理（F、J、N），每块小区取98%棉隆微粒剂150 g与土壤搅拌均匀，覆盖不透气的塑料膜，用开沟压边法（内侧压土）密封好四边，塑料膜覆盖半个月后，再掀膜透气半个月后再种球；②热水处理（D、H、L），每块地灌入50 ℃热水后薄膜覆盖保持土壤温度；③乙醇处理（E、I、M），每块小区喷施2%乙醇10 kg，用塑料膜覆盖半个月后，再掀膜透气；④对照组CK（G、K、O）。试验地四周设有保护行，每个处理3个小区，总共12块小区，每块小区1.2 m×3 m，随机分布。种球围径14～16 cm，每个小区种植10行，每行9粒球，球间距15 cm，种植深度15 cm。
1.3 研究方法
1.3.1 样本采集
样本采集于2020年1月、3月和4月，在4个不同处理组中进行，按照五点取样法，采集表层土壤（0～15 cm）共计1 kg左右，每个样地设3个样方。土壤取样分为3个时期：1）幼苗期（D、E、F、G）：百合植株长到10 cm左右进行一次取样；2）现蕾期（H、I、J、K）：百合植株开始现蕾时进行第二次取样；3）成花期（L、M、N、O）：百合花苞开始采摘时进行第三次取样。土壤样品过4目筛后分成2份，保存于4 ℃冰箱。
1.3.2 DNA提取和Illumina测序
土壤微生物总DNA采用PowerSoil Kit （MoBio Laboratories Carlsbad，CA, USA）试剂盒提取， DNA用NanoDrop ND-1000分光光度计分析（Thermo，USA)，质量浓度为20 ng·μL−1，质量合格的DNA储存于−20 ℃用于后续分析。
1.3.3 序列分析和真菌鉴定
标准真菌ITS测序引物：上游引物ITS5F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，下游引物ITS1R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。PCR扩增体系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol·L−1） 2 μL，ITS5F（10 μmol·L−1）1 μL，ITS1R（10 μmol·L−1）1 μL，DNA Template 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5® High-Fidelity DNA Polymerase 0.25 μL。反应程序：预变性98 ℃ 2 min；变性 98 ℃ 15 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，25～30个循环；再延伸72 ℃ 5 min， 10 ℃保温。扩增产物280 bp大小，PCR产物用VAHTSTM DNA磁珠纯化（诺维赞，南京），并用Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒定量（Invitrogen，美国）对PCR产物在Microplate reader (BioTek，FLx800)上进行定量。
1.3.4 试验上机流程
整个上机流程包括PCR的扩增、PCR产物的混样、纯化，文库的构建和上机测序流程由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。本试验中，基于Illumina MiSeqPE250测序平台，利用双末端测序的方法对16S rDNA 高变区V3~V5区和ITS1区域进行测序。生物信息学分析依据QIIME2 2019.4。
1.4 数据处理与分析
在相似性 97%的水平上对 Tags 序列进行聚类（USEARCH，version 10.0），以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤 OTU，进行组间差异显著性（LEfSe）分析，alpha 指数、Beta 多样性分析[19]。
2. 结果与分析
2.1 不同处理对百合幼苗期生长发育的影响
如图1所示，通过棉隆、热水和乙醇处理，对幼苗期百合的生长性状观察，与CK对照组（图1d）相比，热水处理（图1c）植株生长农艺性状较为一致，且株高最高，其次为乙醇（图1b）和CK对照，而经棉隆处理（图1a）的百合在生长的幼苗期生长缓慢，受到棉隆的抑制。
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图 1 不同处理百合幼苗期田间生长性状注：a，棉隆处理；b，乙醇处理；c，热水处理；d，空白对照。Figure 1. Growth of Lilium seedlings after treatmentsNote: a: dazomet treatment; b: alcohol treatment; c: hot water treatment; d: control.2.2 不同处理土壤真菌群落多样性
如图2所示，经过质量控制后，总共得到 472440 条高质量序列（每个样品23488～59592条序列）（图2a）， 410 个OTU（每个样品 378～471 个OTU），这些OTU归属于 13 个门，22 个纲，16个目，11个科，47个属和85个种（图2b）。
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图 2 不同处理对百合真菌群落多样性的影响Figure 2. Effect of disinfection on fungal community diversity of Lilium rhizosphere soil2.3 不同处理土壤真菌物种分类统计
由图3可看出，各组样品优势菌属主要分布在被孢霉门（Mortierellomycota）、子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门 (Basidiomycota) 、毛霉门（Mucoromycota）、丝足虫类 (Cercozoa) 、壶菌门(Chytridiomycota)、Aphelidiomycota、罗兹菌门（Rozellomycota）、浮霉菌门(Blastocladiomycota)、蛙粪霉门 （Basidiobolomycota）和捕虫霉门 （Zoopagomycota）。其中子囊菌门相对丰度最高，其次是担子菌门。4个处理组分别都是子囊菌门＞担子菌门＞被孢霉门，其中热水处理组在成花期时被孢霉门增至20.94%，变化幅度最大；棉隆组在现蕾期和成花期时担子菌门下调幅度最大。
2.4 不同处理土壤间有差异的真菌物种分析
从图4纵向聚类结果看，不同处理在属分类水平上主要是青霉菌属（Penicillium）、篮状菌属（Talaromyces）、沙蜥属（Saitozyma）、海洋真菌（Westerdykella）距离较近，枝长较短；紧密帚枝霉（Sarocladium）、球腔菌属（Mycosphaerella）、核果褐腐病菌（Monilinia）、榛色钩囊菌（Hamigera）距离较近，枝长较短；绿藻源真菌（Acremonium）、被孢霉菌（Mortierella）距离较近；酵母属（Remersonia）、嗜热真菌属（Mycothermus）距离较近；微囊菌属（Microascus）、金孢属（Chrysosporium）、寄生属（Hypomyces）距离较近；月状弯孢霉（Curvularia）、镰刀菌（Fusarium）、阔足柄孢壳菌（Zopfiella）、麹菌（Aspergillus）距离较近；说明这些菌群在各样品中组成较相似。
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图 4 不同处理组真菌差异物种相对丰度热图注：颜色越黄土赭色表明丰度越低；反之，颜色越蓝代表丰度越高。Figure 4. Heat map of fungi relative abundance in soilsNote: the more loess and ochre the color is, the lower the abundance; conversely, the bluer the color, the higher the abundance.根据 OTU 丰度进行聚类分析，评判百合不同发育时期在属水平上群落结构的差异性和相似性。结果表明，3个发育阶段的优势菌群存在明显差异。在百合幼苗期主要的优势菌是热链球菌属（Mycothermus）、酵母属（Remersonia）、曲霉属（Aspergillus）和子囊菌（Zopfiella）；现蕾期优势菌是海洋真菌（Westerdykella）、钩囊菌（Hamigera）、链核盘菌属（Monilinia）和镶刀菌属（Fusarium）；成花期优势菌是被孢霉属（Mortierella）、寄生菌属（Hypomyces）、金孢子菌属（Chrysosporium）和微囊菌属（Microascus）。此外，3个不同处理组之间在3个百合发育阶段的菌群变化也较为明显，其中棉隆处理菌群变化较大，后期主要是引起寄生菌属（Hypomyces）、金孢子菌属（Chrysosporium）和微囊菌属（Microascus）的增加，在百合生长期内主要病原菌镶刀菌属（Fusarium）丰度一直维持在低水平，而益生菌酵母属（Remersonia）同时受到抑制，丰度不断下降；热水处理后期被孢霉属（Mortierella）、酵母属（Remersonia）增加；乙醇处理后期主要是引起曲霉属（Aspergillus）和子囊菌（Zopfiella）减少；空白对照组后期主要是子囊菌（Zopfiella）增加。
根腐病菌和青霉菌属是引起百合地下根腐和基腐病的2个主要病原菌。高通量测序结果如图5所示，3种处理和对照组之间百合主要的2种病原菌根的发生规律是不同的，2种病原菌占全部真菌比例（百分比）存在明显差异。乙醇在各个阶段中这2种病原菌的百分比含量基本保持不变，而CK组是随着生长发育过程，2种病原菌也同样滋生生长，而热水处理和棉隆处理组中2种病原菌随着生长发育不断减少，尤其在成花期时基本消失。
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图 5 3个不同生长阶段中2种主要病原菌的百分比变化Figure 5. Changes on proportion of 2 major pathogens at 3 Lilium growth stages2.5 基于OTUs的主坐标分析及样品间的NMDS分析
由图6可知，进一步基于样本OTU水平的相异系数bray-curtis距离矩阵进行主坐标分析表明，热水、乙醇和棉隆处理组真菌群落结构与CK差异显著（P＜0.01），第一主成分解释了群落结构差异的53.2%，第二主成分解释了群落结构差异的20.1%（图6a）；热水处理组、乙醇处理组、棉隆处理组和CK组距离较远，相似性低，差异程度大（图6b）；各处理均能显著改变真菌群落结构。
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图 6 不同处理真菌菌群主坐标及NMDS分析Figure 6. Principal coordinates and NMDS analyses on fungal community under different treatments3. 讨论与结论
百合作为一种经济价值很高的园艺植物，除了鲜花百合，还有食药用百合。国内百合种植主产区分布于福建、广东、云南、甘肃及江西等地，各地随着常年重茬，百合病害发生不断扩大，其中最为主要的是真菌性病害[20]。百合系列品种，不管是北方还是南方，通常种植在温室大棚中，因多年连作，真菌病害相对严重，主要是丝核菌、疫霉菌和腐霉菌等[21]；此外，通过系统调查研究表明，福建省百合真菌病害（12种）主要包括炭疽病、灰霉病、曲霉病、枯萎病等[22]。由于真菌病害在发病潜伏期和初期在地上部很难通过肉眼观测分析，因此百合通常连作障碍克服方法包括：农业防治、化学防治和生物防治方法[23]，例如：采取倒茬轮作、土壤改良、生防菌和土壤消毒等措施进行有效的防治研究。
研究表明，连作会影响设施栽培百合土壤中益生菌与致病菌群间的平衡关系，易形成连作障碍[24]。百合根际土壤微生物种类和数量因其不同的生长发育阶段和品种的差异而改变[25]。本文中通过真菌物种分类分析表明，4个组别中土壤的优势菌在不同生育期都发生变化，尤其是热水处理在百合成花期被孢霉门提高至20.94%，此外，棉隆处理在现蕾期和成花期担子菌门下调最为明显；2种病原菌（根腐病菌和青霉菌属）随着生长发育过程，在成花期阶段不发生。同时热水处理对百合植株的田间农艺性状表现最好，不仅生长速度一致，而且幼苗期生长快速，棉隆处理虽然后期对病原菌具有抑制作用，但幼苗期生长缓慢，后期完全恢复，说明棉隆的残留致使前期植株生长受到一定抑制。虽然先前研究对百合重茬的药效试验结果也表明棉隆效果最佳[26]，但建议利用棉隆进行克服连作障碍的处理，应该还要考虑棉隆残留影响和中后期益生菌等配合使用为优。
土壤类型是影响真菌种群的重要因素之一，对土壤真菌物种丰度、Alpha多样性、Beta多样性均有显著影响[27]。相比于传统的微生物平板培养法和生物标记法等土壤微生物研究方法，高通量测序技术可以解决无法培养的土壤微生物菌群，覆盖度更高，多样性和丰富度更好[28]。通过土壤真菌群落多样性分析表明，OUT数量、物种数目、真菌的多样性和丰富度很高。总真菌群落存在差异，棉隆处理（F)最高，空白对照（G)次之，热水处理与乙醇处理菌落数量差异不大。4个组别中子囊菌门相对丰度最高，是绝对的优势菌群，其次是担子菌门和被孢霉门。如热水处理后期引起被孢菌属增加，研究表明被孢霉菌株将可能显著提高了土壤可溶性有机碳[29]；其次，酵母属可能对土壤修复起一定的作用[30]，所以推测这些益生真菌滋生可能与热水处理之间有一定的关联。
本研究结果表明，通过对百合土壤的不同方法处理，各组土壤根际微生物发生了显著变化，除棉隆处理外，热水处理和乙醇处理相对空白对照总菌群数减少。在真菌群落组成中，土壤根际真菌主要以子囊菌门为主，热水处理不仅降低了有害菌（根腐病菌和青霉菌属），而且提高了有益菌被孢霉门和酵母属，促进了百合在幼苗期的良好生长，从研究角度上看，它是解决百合连作障碍的一条有效物理防治方法。但考虑到热水处理在南方地区的田间推广难度大，可操作性差，因此，建议棉隆应充分解除残留后，增施有益菌是最为有效快速解决连作障碍的方法。
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图 1 不同处理百合幼苗期田间生长性状
注：a，棉隆处理；b，乙醇处理；c，热水处理；d，空白对照。
Figure 1. Growth of Lilium seedlings after treatments
Note: a: dazomet treatment; b: alcohol treatment; c: hot water treatment; d: control.
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图 2 不同处理对百合真菌群落多样性的影响
Figure 2. Effect of disinfection on fungal community diversity of Lilium rhizosphere soil
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图 4 不同处理组真菌差异物种相对丰度热图
注：颜色越黄土赭色表明丰度越低；反之，颜色越蓝代表丰度越高。
Figure 4. Heat map of fungi relative abundance in soils
Note: the more loess and ochre the color is, the lower the abundance; conversely, the bluer the color, the higher the abundance.
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图 5 3个不同生长阶段中2种主要病原菌的百分比变化
Figure 5. Changes on proportion of 2 major pathogens at 3 Lilium growth stages
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