Functional Analysis on CgRAB4 of Colletotrichum graminicola
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摘要:目的 阐明禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicola）中CgRAB4的功能，为探究Rab蛋白在禾谷炭疽病菌中的保守性和特殊功能奠定理论基础。方法 通过同源重组的方法对CgRAB4
进行基因敲除，经潮霉素抗性筛选和PCR验证后获得缺失突变体，进而分析其在禾谷炭疽菌生长发育和侵染致病过程中的作用。 结果 成功获得CgRAB4基因的3个缺失突变体和1个异位整合突变体，对其表型分析发现CgRAB4基因缺失后促进了菌丝的生长，但不影响菌丝的形态，且不参与调控外界胁迫的响应过程，产孢量、孢子形态、附着胞的产生以及对玉米的致病性都没有明显变化。结论 通过对CgRAB4基因进行敲除，表型分析后发现该基因可能参与调控禾谷炭疽菌的生长过程，为揭示Rab蛋白在禾谷炭疽菌生长发育和侵染致病过程的作用奠定理论基础，为防治玉米炭疽病提供理论指导。Abstract:Objective Conserve and special functions of Rab4 protein of Colletotrichum graminicola (Cg)were studied. Method Based upon the principle of homologous recombination, CgRAB4 was knocked out from the DNA of Cg to obtain mutants with the target gene deleted. A hygromycin-resistance screening and PCR verification were performed on the mutants prior to a functional analysis on Cg development and pathogenesis.Result Three CgRAB4-deleted and one ectopic mutants were secured by the designed process. The phenotypic analysis revealed that the deletion promoted the hypha growth but did not affect the mycelial morphology, nor regulate the response to external stress or significant change in the spore production and morphology, appressorium germination or the pathogenicity on the mutants.Conclusion CgRAB4 was successfully removed from Cg to unveil the involvement of the gene in regulating the mycelial growth. Understanding on the roles of Rab proteins played in the development and pathogenesis of Cg provided a guiding direction for further research on the prevention and treatment of corn anthrax.-
Keywords:
- Colletotrichum graminicola /
- CgRAB4 /
- knock out /
- phenotypic analysis
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0. 引言
【研究意义】鸭3型甲肝病毒（Duck hepatitis A virus type 3, DHAV-3）是雏鸭的高致死性传染病病原之一，主要感染3周龄内雏鸭，其传播速度快，感染率达100%，致死率为80%，给养鸭业带来严重的危害。开展DHAV-3的分离鉴定，同时对VP1基因进行遗传进化分析，可为鸭3型甲肝病毒的致病机制研究和疫苗研发积累素材、提供理论参考。【前人研究进展】鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus, DHAV）属于小RNA病毒科（Picornaviridae）禽肝病毒属（Avihepatovirus）[1]，可分为3个不同的血清型，即鸭1型甲肝病毒（DHAV-1）、鸭2型甲肝病毒（DHAV-2）、鸭3型甲肝病毒（DHAV-3）[2]。其中DHAV-1在美国、英国、中国、埃及等都有传播[3]，DHAV-2目前仅在中国台湾和印度发生并报道[4,5]，DHAV-3为中国、韩国、越南等国家的主要流行血清型。2002年苏敬良等[6]从北京和广西疑似鸭病毒性肝炎的病例中分离鉴定出2株血清型有别于DHAV-1的新发病毒（B株和G株），并暂定名为新型鸭肝炎病毒（New type duck hepatitis virus, DHV-N）。随后，2005年胡薛英等[7]测定新型鸭肝炎病毒感染雏鸭后的血液生化指标发现，鸭血清葡萄糖、总蛋白、白蛋白含量和谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性的变化规律与感染DHAV-1雏鸭的变化规律相一致。2009年，施少华等[8]对DHV-NG株进行基因组序列分析，表明DHV-NG株其全基因组不同于DHAV-1。2007年，Kim等[9]在类似鸭病毒性肝炎病例中分离鉴定到新的血清型，并命名为鸭3型甲肝病毒（DHAV-3）。DHAV-3的核酸为单股正链RNA，以高度浓缩状态位于成熟病毒颗粒中，其基因组长度约为7.7 kb，仅有单个开放阅读框（ORF）及两侧的5′和3′非编码区（5′-UTR和3′-UTR）[10,11]。该ORF编码一个假定多聚蛋白，该多聚蛋白又被分为一个结构蛋白复合体（P1）、两个非结构蛋白复合体（P2和P3）。在病毒编码的蛋白水解酶作用下，P1复合体可依次被水解为VP0、VP3和VP1等3 种衣壳蛋白，P2和P3复合体被水解成9种非结构蛋白，包括2A1、2A2、2A3、2B、2C、3A、3B、3C和3D等[12,13]。其中VP1蛋白具有特异性中和抗体，在致病性、进化、毒力中起极其重要的作用[14]。VP1区存在多个免疫优势辅助性T淋巴细胞抗原位点及其抗原决定簇，构成主要的T、B淋巴细胞抗原表位，诱导机体产生中和抗体，且与病毒基因型和血清型的多样性有关[15]。此外，VP1 蛋白的变异体现了DHAV-3的流行特点[8]。【本研究切入点】2023年2月在安徽省某鸭场出现大量死亡雏鸭，剖检可见肝脏肿大、出血，然而引起该病的病因尚不清楚。【拟解决的关键问题】为明确其病因及遗传变异情况，本研究通过采集死亡雏鸭的肝脏进行细菌分离培养、（RT-）PCR检测，最终确定其病原为鸭3型甲肝病毒；对该分离株的VP1基因进行测序分析，明确其遗传进化规律，为后续疫苗研制和开展相关研究提供依据。
1. 材料与方法
1.1 病鸭样品来源
采自安徽某发病鸭场的肝脏组织，死亡雏鸭临床症状为角弓反张，剖检可见肝脏肿大、出血。
1.2 试验材料与试剂
半番鸭胚和雏樱桃谷鸭购自福建温氏有限公司；病毒核酸提取试剂盒（SimpiyP Virus DNA/RNA Extraction Kit）购自BioFlux公司；去基因组DNA的RNA反转录试剂盒（PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser）（Perfect Real Time）、DNA Maker 购自Takara公司；M5 DNA电泳用琼脂糖购自Mei5bio公司。
1.3 样品处理
将所采集的疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝脏分为2份，一份在4 ℃保存进行细菌分离，另一份在超净工作台内无菌分装，剪碎后加入1%灭菌生理盐水研磨制成混悬液，
3000 r·min−1离心5 min，收集上清液，用于PCR鉴定，反复冻融3次后，经0.22 μm滤膜过滤除菌后−80 ℃保存备用。1.4 引物设计与合成
根据NCBI上已公布的DHAV-3 VP1基因序列和DHAV-3基因序列，利用Premier 5.0设计1对针对VP1基因全长的引物和DHAV-3鉴别引物（表1）。参考前人文献分别合成鸭1型甲肝病毒（Duck hepatitis A virus type 1, DHAV-1）[16]、鸭星状病毒（Duck astrovirus, DAstV）[17]、鸭3型腺病毒（Duck adenovirus type 3, DAdV-3）[18]、禽流感病毒（Avian influenza viruses, AIV）[18]、番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus, MDPV）[19]、鹅细小病毒（Goose parvovirus virus, GPV）[19]和番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus, MDRV）[20]等的检测引物，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。
表 1 RT-PCR扩增引物Table 1. Primers for RT-PCR amplification引物名称
Primers引物序列
Sequences（5′-3′）退火温度
Annealing temperature/ ℃片段长度
Product size/bpDHAV-3 VP1 F：ATGGCCGCCAATAACCAGGGTGATTC 55 738 R：TTCAATTTCCAAATGGAGCTCAAAGGCAAGTG DHAV-3 F：CACAAACAGCGTAAACGCCA 52 211 R：GCAAGCCTTGGGGATTTTGG 1.5 核酸提取和RT-PCR鉴定
按照RNA提取试剂盒（SimpiyP Virus DNA/RNA Extraction Kit）说明书操作步骤提取病毒核酸。利用去基因组DNA的RNA反转录试剂盒（PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser）（Perfect Real Time），按照说明书将提取的RNA反转录为cDNA；以上述cDNA为模板，用合成的DHAV-3、DHAV-1、 DAstV、DAdV-3、AIV、MDPV、GPV和MDRV等引物进行PCR扩增。PCR反应体系（20 μL）：Dream Taq Green Mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板2 μL，双蒸水补足至20 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，50~53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。扩增产物进行1%琼脂糖电泳。
1.6 病原分离
将上述提取上清以0.2 mL·枚−1的剂量接种于11日龄半番鸭胚（不含感染鸭常见病毒）中，置于37 ℃培养箱中孵育。剔除24 h内死亡的鸭胚，收集48～120 h内死亡的鸭胚，无菌收取其尿囊液，在半番鸭胚中盲传5代后进行DHAV-3鉴定。
1.7 鸭胚的半数致死量（ELD50）测定
取所收集的尿囊液，分别按不同的稀释度（10−1、10−2、10−3、10−4、10−5、10−6、10−7、10−8、10−9）接种11日龄半番鸭胚，每组接种5枚，接种量为0.1 mL·枚−1，同时5枚接种0.1 mL生理盐水，作为对照处理组。置于37 ℃培养箱中孵育，每隔12 h观察一次，每天照蛋两次，弃除24 h死亡鸭胚。观察并记录鸭胚的死亡情况，按照Reed-Muench法计算分离毒株对鸭胚半数致死量（ELD50）[21]。
1.8 动物回归试验
以每羽0.5 mL 200 ELD50的分离毒株经腿部肌肉注射于无DHAV-3母源抗体的3日龄健康樱桃谷鸭，共接种5羽，另取5羽注射等剂量的无菌生理盐水作为对照组，隔离饲养，连续观察7 d，记录动物的临床症状以及死亡数量。该试验动物方案经福建农业科学院伦理和动物福利委员会批准，并按照《实验动物护理和使用指南》进行。
1.9 鸭3型甲肝病毒VP1基因测序与分析
用表1中DHAV-3 VP1基因全长引物对分离株进行PCR扩增，按1.5中的扩增条件进行，经1%琼脂糖电泳后将得到的阳性条带送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。采用DNAStar Lasergene 7对测序结果与GenBank中登录的16株DHAV参考株（表2）VP1基因进行序列比对，用MEGA11和Meg Align软件进行相似性分析并构建系统进化树。
表 2 DHAV参考毒株Table 2. Reference DHAV strains登录号
Locus毒株
Virus血清型
Serotype分离时间
Time分离地
IsolateJX390982 FZ86 DHAV-1 1986年 中国福建
Fujian, ChinaDQ219396 DRL-62 DHAV-1 1962年 美国
USAJX390984 FZ99 DHAV-1 1999年 中国福建
Fujian, ChinaDQ812092 DHV-HSS DHAV-1 1995年 韩国
KoreaEF067924 90D DHAV-2 1990年 中国台湾
Taiwan, ChinaEF067923 04G DHAV-2 2004年 中国台湾
Taiwan, ChinaDQ256133 AP-04009 DHAV-3 2004年 韩国
KoreaDQ256132 AP-03337 DHAV-3 2003年 韩国
KoreaEU75509 G DHAV-3 2002年 中国广西
Guangxi, ChinaKU860089 NC DHAV-3 - - GQ485310 SD01 DHAV-3 2008年 中国山东
Shandong, ChinaHQ654774 JS2010 DHAV-3 2010年 中国江苏
Jiangsu, ChinaMH752739 CH DHAV-3 2015年 中国四川
Sichuan, ChinaKP995438 EY DHAV-3 2014年 中国山东
Shandong, ChinaMN953474 SD DHAV-3 2011年 中国山东
Shandong, ChinaMT767252 AH07 DHAV-3 2018年 中国安徽
Anhui, China2. 结果与分析
2.1 细菌分离培养
将采集的肝脏组织用接种环无菌采集接种于胰酪大豆胨琼脂培养基上，37 ℃培养24 h后，未见细菌分离，可排除细菌感染。
2.2 临床样品RT-PCR检测
临床样品RT-PCR检测发现，在211 bp左右有扩增条带，与DHAV-3特异性检测引物扩增条带大小相符；未见其余鸭常见病毒扩增条带（图1）。
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图 1 临床样品RT-PCR检测M为2000 DNA Maker，1为鸭3型甲肝病毒，2为鸭3型腺病毒，3为禽流感病毒，4为番鸭细小病毒，5为鹅细小病毒，6为番鸭呼肠孤病毒，7为鸭1型甲肝病毒，8为鸭星状病毒，9为阴性对照。Figure 1. RT-PCR detection on clinical samplesM: 2000 DNA marker; 1: DHAV-3; 2: duck adenovirus type 3 (DAdV-3); 3: avian influenza virus (AIV); 4: Muscovy duck parvovirus (MDPV); 5: goose parvovirus (GPV); 6: Muscovy duck reovirus (MDRV); 7: DHAV-1; 8: duck astrovirus (DAstV); 9: control.2.3 病毒分离鉴定结果
组织研磨液接种于11日龄半番鸭胚，接毒后3 d出现死亡，胚体全身出血（图2）。经RT-PCR对第5代鸭胚尿囊液进行检测显示，在鸭胚上传5代后的样品出现与预期大小相符的目的条带（约211 bp）（图3）；将目的条带克隆至pMD-20T载体转化后进行测序和分析，测序结果初步确定该病毒为DHAV-3，命名为AH230225株。
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图 2 死亡鸭胚体变化A为正常鸭胚；B为死亡鸭胚。Figure 2. Changes occurred to dead duck embryoA: normal duck embryo; B: dead duck embryo.![]()
图 3 分离株RT-PCR检测M为2000 DNA Maker，1为阳性对照，2为AH230225，3为阴性对照。Figure 3. RT-PCR detection of isolatesM: 2000 DNA marker; 1: positive control; 2: AH230225; 3: control.2.4 病毒的ELD50测定
经测定，分离株AH230225株的ELD50值为10−4.17/0.1 mL。
2.5 动物回归试验
攻毒组雏鸭在攻毒后72 h开始出现死亡，在攻毒后168 h内AH230225株的死亡率达到80%（表3）。死亡雏鸭呈现典型的DHAV-3病理变化，主要表现为肝脏表面斑点状出血明显、肾脏出血，其他器官剖检变化不明显（图4），而对照组没有出现任何症状。
表 3 樱桃谷鸭动物回归试验结果Table 3. Animal regression test results on Cherry Valley ducks组别
Groups数量
Number/
羽攻毒后7 d内的死亡鸭数量
Number of dead ducklings during
7 days post infectious/羽死亡率
Mortality/%1 2 3 4 5 6 7 AH230225 5 0 0 2 1 1 0 0 80 (4/5) 对照组CK 5 0 0 0 0 0 0 0 0(0/5) 2.6 DHAV-3 VP1基因序列分析
利用设计的引物对DHAV-3分离株（AH230225株）的VP1基因进行扩增，并设置标准阳性和阴性对照。结果显示，在738 bp左右出现与目的条带大小相符的片段（图5）。将AH230225株与GenBank的16株DHAV分离株VP1基因进行同源性和遗传进化分析，结果显示：AH230225株的VP1基因核苷酸序列与DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3的VP1基因核苷酸序列同源性分别为62.1%~63.0%、64.6%~64.9%、90.4%~98.8%（图6）。由此可见，该分离株基因核苷酸序列与DHAV-3的同源性最高，而与DHAV-1的最低。遗传进化树结果显示：AH230225与安徽株（AH07株）、山东株（EY、SD株）、四川株（CH株）和江苏株（JS2010株）在同一进化分支，亲缘关系较近，与山东株（SD01株）、广西株（G株）、韩国株（AP-04009、AP-03337株）亲缘关系较远，表明该分离株（AH230225株）可能来源于DHAV-3 AH07株（图7）。
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图 5 AH230225株VP1基因PCR扩增M为2000 DNA Maker，1为阳性对照，2为AH230225，3为阴性对照。Figure 5. PCR amplification map on VP1 of AH230225M: 2000 DNA marker; 1: positive control; 2: AH230225; 3: control.3. 讨 论
DHAV-3由苏敬良等[1]在2002年首次发现，并暂定名为新型鸭肝炎病毒（DHV-N），2007年在韩国报道出现[8]，然后传播到越南[22]，2020年又传播到埃及[23−25]，严重危害全球养鸭业的健康发展。在我国，2012年以前流行的鸭甲型肝炎病毒主要是DHAV-1，由于DHAV-1弱毒疫苗的广泛应用，自2013年以后DHAV-3逐渐成为优势流行毒株，在所有的DHAV流行毒株中DHAV-3占比可达57.1%[26]。2013年徐倩等[27]对我国60份不同省份26个养鸭场的临床样本进行检测，结果显示所有临床样品中DHAV-3占比30%，DHAV-1占比18.3%；2017年Zhang等[28]对山东省内采集的482只死亡樱桃谷鸭肝脏样本进行检测，DHAV-3的检出率为64.5%（311/482），雏鸭粪便的检出率为70.3%（92/126）。2023年Yang等[29]分析1986–2020年DHAV-3分离株的全基因组序列发现我国的DHAV-3分离株存在5个亚分支（a~e）。总之，DHAV-3在我国广泛传播，对我国养鸭业造成巨大损失。DHAV-3的病原分离鉴定、流行趋势和致病性分析可为该病的防控措施和疫苗研发提供科学依据。本研究从安徽省某雏鸭场分离并鉴定了一株DHAV-3分离株（AH230225株），可在鸭胚中增殖，胚体死亡时间稳定在3~5 d；该分离株的动物回归试验成功复制了临床症状，表现为肝脏与肾脏肿大、出血，特别肝脏病变最严重，其他组织器官病变不明显，这与先前的研究一致[30, 31]，可以明确DHAV-3的靶器官为肝脏和肾脏。
VP1蛋白是组成小RNA科病毒衣壳的主要蛋白，位于核衣壳表面，决定小RNA病毒科的血清型和生物学特性[32]。DHAV为小RNA病毒科成员，其VP1蛋白在致病性、进化和毒力中起着重要作用。据研究报道，DHAV中的VP1蛋白氨基酸突变可能还会引起病毒的毒力或抗原性改变[33]。此外，该基因存在一个高度可变区，因此，分析VP1基因的变异情况对该病毒的遗传变异有重要意义[32]。本研究通过对DHAV-3分离株（AH230225株）VP1基因的测序结果分析显示，该分离株VP1基因的核苷酸序列与GenBank发表的10株鸭3型甲肝病毒的同源性均在90%以上，且与AH07株相似性最高，为98.8%，与SD株、EY株相似性为98.4%。遗传进化树结果显示与安徽AH07株处于同一进化小分支上，亲缘关系较近，与SD01株、G株、AP-04009株和AP-03337株亲缘关系较远，表明该鸭场流行的毒株与国内的主要流行株一致。
综上所述，DHAV-3对雏鸭危害严重，一旦感染，死亡率可达80%。本研究通过病毒分离、RT-PCR鉴定、动物回归试验等，鉴定该病原为DHAV-3，该病毒与近年来分离的DHAV-3毒株同源性高，对雏鸭的致病性强。这些研究数据可为后续鸭3型甲肝病毒的综合防治提供理论参考。
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图 1 同源重组的敲除策略（A）和SOE-PCR热循环体系（B）
Figure 1. Homologous recombination knockout (A) and SOC-PCR system (B)
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图 2 SOE-PCR扩增AH和HB
注： M: DL2000 marker。
Figure 2. SOE-PCR amplifications of AH and HB
Note: M: DL2000 marker.
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图 3 转化子的DNA提取与验证
注：M: DL2000 marker M2: 野生型基因组DNA。
Figure 3. DNA extraction and verification on transformants
Note: M: DL2000 marker; M2: DNA of wild type genome.
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图 4 禾谷炭疽菌CgRAB4缺失突变体的生长发育
注：①A：菌落形态 ；B：菌丝生长速率； C：菌丝形态。②不同小写字母表示差异达显著水平（ P ＜0.05），下同。
Figure 4. Development of CgRAB4-deleted mutants
Note: ①A: colony morphology; B: growth rate; C: mycelial morphology.② Data with different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level, the same as below.
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图 5 CgRAB4缺失突变体胁迫响应试验
注：A：含有不同添加物的CMII培养基上CgRAB4缺失突变的菌落形态；B：CMII培养基上的抑制率 ；C：含有不同添加物的PDA培养基上CgRAB4缺失突变的菌落形态；D：PDA培养基上的抑制率。
Figure 5. Stress responses of CgRAB4-deleted mutants
Note: A: colony morphology of CgRAB4-deleted mutants obtained on CMII media containing varied supplements; B: inhibition rate on CMII media; C: colony morphology of CgRAB4-deleted mutants obtained on PDA media containing varied supplements; D: inhibition rate on PDA media.
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图 6 CgRAB4缺失突变体产孢量和孢子形态
注：A：产孢量统计；B：孢子形态观察。
Figure 6. Conidiations and spore morphology of CgRAB4-deleted mutants
Note: A: conidiation; B: spore morphology.
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图 7 CgRAB4缺失突变体的孢子萌发和附着胞形态
注：A：24 h孢子萌发产生附着胞；B：48 h 附着胞形态。
Figure 7. Spore germination and appressorium morphology of CgRAB4-deleted mutants
Note: A:the spores germinate to produce appressorium on 24 h; B: morphology of appressorium on 48 h.
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图 8 CgRAB4缺失突变体对玉米的致病性
注：A：造伤接种；B：喷雾接种。
Figure 8. Pathogenesis of CgRAB4-deleted mutants on corn
Note: A: injury inoculation; B: spray inoculation.
表 1 供试培养基
Table 1 Culture media applied
名称
Name配方
Ingredient添加物
Supplement用途
ApplicationMK 40 g米糠 不含添加物的固体培养基用于禾谷炭疽菌野生型以及缺失突变体的生长速率的测定 20 g琼脂粉 CMII 50 mL N源 氯化钠 NaCl 含添加物的固体培养基用于禾谷炭疽菌野生型以及缺失突变体胁迫敏感性测定 1 mL 微量元素
Trace elements氯化钾 KCl 1 mL维生素
Vitamin solution山梨醇 Sorbitol 10 g D-葡萄糖 十二烷基硫酸钠 SDS 2 g 蛋白胨 Peptone 荧光增白剂 CFW 1 g 酵母提取物
Yeast extraction刚果红 CR 1 g（酸水解酪蛋白） Casamino acids pH6.5 PDA 氯化钠 NaCl 液体培养基用于禾谷炭疽菌野生型以及缺失突变体生物量测定 46 g·L−1 马铃薯葡萄糖
Potato dextrose氯化钾 KCl 15 g·L−1 琼脂粉 Agar 山梨醇 Sorbitol 十二烷基硫酸钠 SDS 荧光增白剂 CFW 刚果红 CR TB3 200 g·L−1 蔗糖 Sucrose 用于原生质体再生 6 g·L−1 酸水解酪蛋白
Casamino acids6 g·L−1 酵母提取物
Yeast extract15 g·L−1 琼脂粉 Agar 
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表 2 供试引物序列
Table 2 Sequence of primer employed
引物名称
Primer引物序列
Sequence引物用途
ApplicationCgRAB4 AF CGAATGGGAGTTAGGGTG 扩增A片段
Applification of A fragmentCgRAB4 AR TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAA
GCCACAGCAGTCGGTTGGTTCgRAB4 BF GAATAGAGTAGATGCCGACCGCGG
GTTTTTGGTTTACCTGACGAT扩增B片段
Applification of B fragment
CgRAB4 BR CTTCACCTCTTGCTCCTG CgRAB4 OF CTCCCAACTTGTCTTGCCTTCT 敲除突变体的验证
Verification of knockout mutantsCgRAB4 OR TCGCCTGCCCTTTCGTCT CgRAB4 UAF CGCAGAGTCAGCGTCAAT H853 GACAGACGTCGCGGTGAGTT YG/F GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT 扩增潮霉素基因全长
Amplification of full length of hygromycin geneHY/R GTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAA HYG/F GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA HYG/R AACCCGCGGTCGGCATCTACTCTATTC
下载: 导出CSV
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