湖北道地药材贝母ISSR反应体系优化及多态性引物筛选

蒋小刚; 王华; 郭坤元; 张美德

doi:10.19303/j.issn.1008-0384.2021.06.004

湖北道地药材贝母ISSR反应体系优化及多态性引物筛选

doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2021.06.004

湖北省农业科学院中药材研究所/国家中药材产业技术体系恩施综合试验站/湖北省农业科技创新中心中药材分中心，湖北　恩施　445000

基金项目: 湖北省重点研发计划项目（2020BCA059）；湖北省农业科技创新中心2020年重大科技研发项目（2020-620-000-002-04）；国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-21）；第三批“湖北省青年英才开发计划”项目［鄂青联发（2020）1号］；湖北省农业科学院中药材研究所技术创新重大项目（2019ZYCZD01）；湖北省中央引导地方科技发展专项资金（2019ZYYD064）；湖北省技术创新专项（2019AKB092）；湖北省农业科学院青年科学基金（2021NKYJJ19）

详细信息

作者简介:
蒋小刚（1991−），男，硕士，研究方向：药用植物育种（E-mail：jxg154113@163.com）

通讯作者:
郭坤元（1986−），男，博士，助理研究员，研究方向：药用植物栽培与育种（E-mail：gtdrenhe@163.com）

中图分类号: S 682
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出版历程
- 收稿日期: 2020-08-23
- 修回日期: 2021-05-24
- 网络出版日期: 2021-06-06
- 刊出日期: 2021-06-28

ISSR Reaction Optimization and Primer Selection for Species Authentication of Fritillaria hupehensis Hsiao et K. C. Hsia

Institute of Chinese Medicinal Materials, Hubei Academy of Agricultural Sciences/Enshi Comprehensive Test Station, National Traditional Chinese Medicine Industry Technology System/Chinese Medicinal Materials Sub-center, Hubei Agricultural Science and Technology Innovation Center, Enshi, Hubei　445000, China

摘要

摘要: 目的优化湖北贝母ISSR-PCR体系，并筛选适用于湖北贝母的多态性引物，为后续湖北贝母的分子辅助育种及遗传多样性和亲缘关系分析等提供科学依据。方法采用U₁₂（4³）均匀设计和单因素试验结合的方法，获得PCR体系各组分（2×Taq Master Mix，模板 DNA，引物）的最佳用量，在此基础上通过梯度退火温度实验探究引物的最佳退火温度。结果湖北贝母ISSR-PCR最佳反应体系为：20 μL反应体系中，2×Taq Master Mix 10.5 μL，模板DNA 0.8 μL（40.0 ng），引物2.2 μL（5.5 μmol），ddH₂O 6.5 μL，ISSR-PCR扩增程序为: 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性0.75 min，54.3 ℃～60.0 ℃退火0.75 min，72 ℃延伸1.5 min，40个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。利用优化的反应体系筛选了6条多态性较好、扩增稳定的引物（UBC848、UBC850、UBC853、UBC857、UBC859、UBC866），其最佳退火温度分别为59.3、58.2、56.9、54.3、59.3和60.0 ℃。用优化的ISSR-PCR体系对12份不同产地的湖北贝母资源进行PCR扩增，结果表明，该反应体系稳定可靠，不同产地湖北贝母具有较丰富的遗传多样性。结论优化的湖北贝母ISSR-PCR反应体系可用于湖北贝母种质资源鉴定、亲缘关系和遗传多样性分析等研究。
- 湖北贝母 /
- ISSR /
- 分子标记 /
- 体系优化
Abstract: Objective The optimized ISSR-PCR reaction system and appropriate polymorphic primers were established to facilitate the authentication, breeding, and genetic studies on Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C. Hsia. Method A U₁₂(4³) uniform design method combined with a single factor screening test was employed to optimize the dosages of 2×Taq Master Mix, template DNA, and primer applied for ISSR-PCR and followed by a gradient temperature experiment to determine the primer annealing temperature. Result The optimal ISSR reaction system used 10.5 μL of 2×Taq Master Mix, 0.8 μL of template DNA (40.0 ng), 2.2 μL (2.5 μmol·L⁻¹) of primers, and 6.5 uL of ddH₂O for a 5 min sequencing at 94 ℃ and 40 cycles at 94 ℃ for 0.75 min, 54.3–60.0 ℃ for 0.75 min, and 72 ℃ for 1.5 min, followed by 10 min at 72 ℃ prior to storage at 4 ℃. Six stable polymorphic primers, UBC848, UBC850, UBC853, UBC857, UBC859, and UBC866 with the optimal annealing temperatures of 59.3, 58.2, 56.9, 54.3, 59.3, and 60.0 ℃, respectively, were selected. On 12 F. hupehensis germplasms from various locations, the optimized ISSR-PCR yielded stable and reliable results that showed abundant genetic diversity. Conclusion The optimized ISSR-PCR reaction system could be satisfactorily applied for the resource authentication and genetic analysis on F. hupehensis.
- Fritillaria hupehensis Hsiao et K. C. Hsia /
- ISSR /
- molecular marker /
- system optimization

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图 1 12份湖北贝母基因组DNA电泳图

注：M：DL2000 DNA Marker；1～12：12份湖北贝母基因组DNA。

Figure 1. DNA electrophoretograms of 12 F. hupehensis germplasms

Note: M: DL2000 DNA marker; 1-12: 12 genomic DNA of F. hupehensis germplasms.

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图 2 12份湖北贝母ITS₂扩增结果

注：M：DL2000 DNA Marker；1～12：12份ITS₂扩增结果。

Figure 2. ITS₂ amplifications on 12 F. hupehensis germplasms

Note: M: DL2000 DNA marker; 1-12: 12 genomic DNA of F. hupehensis germplasms.

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图 3 ISSR-PCR均匀设计U₁₂（4³）扩增结果

注：M：DL2000 DNA Marker；1～12：表3的处理编号，每个处理3个重复。

Figure 3. Results of U₁₂(4³) uniform design experiment for ISSR-PCR

Note: M: DL2000 DNA marker; 1-12: same number codes as shown in Table 3; 3 replicates for each treatment.

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图 4 2×Taq Master mix单因素试验设计的ISSR-PCR

注：M：DL2000 DNA Marker；1～5：表4的处理编号，每个处理3个重复。

Figure 4. ISSR-PCR of single factor screening test on 2×Taq Master Mix

Note: M: DL 2000DNA marker; 1-5: same number codes as shown in Table 4; 3 replicates for each treatment.

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图 5 模板DNA的单因素试验设计的ISSR-PCR

注：M：DL2000 DNA Marker；1～6：表5的处理编号，每个处理3个重复。

Figure 5. ISSR-PCR of single factor screening test on DNA

Note: M: DL2000 DNA marker; 1-6: same number codes as shown in Table 5; 3 replicates for each treatment.

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图 6 引物的单因素试验设计的ISSR-PCR

注：M：DL2000 DNA Marker；1～6：表6的处理编号，每个处理3个重复。

Figure 6. ISSR-PCR of single factor screening test on DNA

Note: M: DL2000DNA marker; 1-6: same number codes as shown in Table 6; 3 replicates for each treatment.

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图 7 引物UBC848不同退火温度扩增

注：M：DL2000 DNA Marker；1：60 ℃；2：59.3 ℃；3：58.2 ℃；4：56.4 ℃；5：54.3 ℃；6：52.7 ℃；7：51.6 ℃；8：51.0 ℃。

Figure 7. Amplification of primer UBC848 at different annealing temperatures

Note: M: DL2000DNA marker; 1: 60 ℃; 2: 59.3 ℃; 3: 58.2 ℃; 4: 56.4 ℃; 5: 54.3 ℃; 6: 52.7 ℃; 7: 51.6 ℃; 8: 51.0 ℃.

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图 8 引物 UBC866对12份湖北贝母资源的扩增结果

注：M：Super DNA Marker；1～12：12份湖北贝母资源。

Figure 8. Amplification results of 12 F. hupehensis germplasms by primer UBC866

Note: M: Super DNA marker; 1-12: 12 F. hupehensis germplasms.

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图 9 12份湖北贝母种质聚类分析

Figure 9. Cluster diagram of 12 F. hupehensis germplasms

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表 1 12份湖北贝母种质资源产地

Table 1. Producing areas of 12 F. hupehensis germplasms

编号 No.	产地 Producing area
FH1	恩施市新塘乡 Xintang Township, Enshi City
FH2	恩施市华中药用植物园 Huazhong Medicinal Botanical Garden, Enshi City
FH3	恩施市板桥镇 Banqiao Town, Enshi City
FH4	恩施市龙凤坝镇 Longfengba Town, Enshi City
FH5	建始县花坪镇 Huaping Town, Jianshi County
FH6	建始县龙坪乡 Longping Township, Jianshi County
FH7	建始县官店镇 Guandian Town, Jianshi County
FH8	建始县高坪镇 Gaoping Town, Jianshi County
FH9	利川市团堡镇 Tuanbao Town, Lichuan City
FH10	利川市汪营镇 Wangying Town, Lichuan City
FH11	利川市元堡乡 Yuanbao Township, Lichuan City
FH12	重庆市奉节县 Fengjie County, Chongqing City

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表 2 ISSR-PCR体系均匀设计U₁₂（4³）

Table 2. U₁₂(4³) uniform design for ISSR-PCR （单位: μL）

水平 Level	模板DNA Template DNA	引物 Primers	2×Taq Master mix
1	0.5	0.5	9.5
2	1.0	1.0	10.0
3	1.5	1.5	10.5
4	2.0	2.0	11.0

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表 3 ISSR-PCR均匀设计U₁₂（4³）

Table 3. Mixed uniform design U₁₂（4³）for ISSR-PCR

（单位: μL）
编号 No.	模板DNA Template DNA	引物 Primers	2×Taq Master mix	ddH₂O
1	1.5	2.0	9.5	7.0
2	2.0	1.0	10.0	7.0
3	1.0	2.0	11.0	6.0
4	2.0	0.5	9.5	8.0
5	1.5	0.5	10.5	7.5
6	0.5	2.0	10.0	7.5
7	0.5	1.0	10.5	8.0
8	1.0	1.0	9.5	8.5
9	1.5	1.5	10.0	7.0
10	1.0	1.5	10.5	7.0
11	2.0	1.5	11.0	5.5
12	0.5	0.5	11.0	8.0

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表 4 2×Taq Master mix的单因素试验设计

Table 4. Single factor screening test on 2×Taq Master Mix

（单位: μL）
编号 No.	模板DNA Template DNA	引物 Primers	2×Taq Master mix	ddH₂O
1	0.5	2.0	9.0	8.5
2	0.5	2.0	9.5	8.0
3	0.5	2.0	10.0	7.5
4	0.5	2.0	10.5	7.0
5	0.5	2.0	11.0	6.5

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表 5 模板DNA的单因素试验设计

Table 5. Single factor screening test on DNA （单位: μL）

编号 No.	模板DNA Template DNA	引物 Primers	2×Taq Master mix	ddH₂O
1	0.2	2.0	10.5	7.3
2	0.5	2.0	10.5	7.0
3	0.8	2.0	10.5	6.7
4	1.0	2.0	10.5	6.5
5	1.5	2.0	10.5	6.0
6	2.0	2.0	10.5	5.5

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表 6 引物的单因素试验设计

Table 6. Single factor screening test on primers （单位：μL）

编号 No.	模板DNA Template DNA	引物 Primers	2×Taq Master mix	ddH₂O
1	0.8	1.2	10.5	7.5
2	0.8	1.5	10.5	7.2
3	0.8	1.8	10.5	6.9
4	0.8	2.0	10.5	6.7
5	0.8	2.2	10.5	6.5
6	0.8	2.5	10.5	6.2

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表 7 ISSR引物最佳退火温度

Table 7. Optimum primer annealing temperature

引物名称 Primer names	序列 Sequence	引物长度 Primer length/ bp	退火温度 Theoretical annealing temperature/ ℃	最佳退火温度 The optimum annealing temperature/ ℃
UBC848	C（AC）₇ARg	18	56.2	59.3
UBC850	（gT）₈YC	18	56.2	58.2
UBC853	（TC）₈RT	18	53.9	56.9
UBC857	（AC）₈Yg	18	56.2	54.3
UBC859	（Tg）₈RC	18	56.2	59.3
UBC866	（CTC）₅	15	56.3	60.0

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表 8 12份湖北贝母遗传相似系数

Table 8. Genetic similarity coefficients of 12 F. hupehensis germplasms

编号 No.	FH1	FH2	FH3	FH4	FH5	FH6	FH7	FH8	FH9	FH10	FH11	FH12
FH1	1.0000
FH2	0.9143	1.0000
FH3	0.9143	0.8857	1.0000
FH4	0.7714	0.7429	0.8571	1.0000
FH5	0.9143	0.8857	0.9429	0.8000	1.0000
FH6	0.8571	0.8857	0.8857	0.7429	0.9429	1.0000
FH7	0.8857	0.9143	0.9143	0.7714	0.9143	0.9143	1.0000
FH8	0.7143	0.6857	0.7429	0.8286	0.7429	0.7429	0.7143	1.0000
FH9	0.7429	0.7714	0.7143	0.7429	0.7143	0.7714	0.7429	0.8000	1.0000
FH10	0.7143	0.6286	0.7429	0.8286	0.6857	0.6286	0.6571	0.7143	0.6286	1.0000
FH11	0.8286	0.7429	0.7429	0.6000	0.8000	0.7429	0.7714	0.5429	0.5714	0.5429	1.0000
FH12	0.9429	0.8571	0.9143	0.7714	0.9143	0.8571	0.8857	0.7143	0.7429	0.7143	0.7714	1.0000

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