BSA-Seq Identification of Blast-resistance Genes in Gufeng B Rice
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摘要:目的 挖掘和鉴定谷丰B稻瘟病抗性基因，了解谷丰B稻瘟病抗性遗传模式。方法 以谷丰B和日本晴杂交获得F1和F2代遗传群体，接种稻瘟菌不同生理小种并分析抗病遗传模式；在F2群体中挑选极端抗/感单株构建DNA混合池，利用群体分离分析法（BSA）定位关联区域。结果 谷丰B对KJ201、RB22、CHNOS、RB6、2Y838-1、501-3和IR16-1等菌株均表现高抗性，表明谷丰B基因组可能携带了广谱高抗稻瘟病基因。谷丰B和日本晴杂交，F1群体表现抗501-3和IR16-1，F2群体的抗病/感病分离比不符合3 ∶ 1，推测谷丰B基因组存在多个位点影响稻瘟病抗性。对F2群体的极端抗病、感病混合池及亲本DNA进行全基因组测序，鉴定了1 756 964个单核苷酸多态性（SNPs）标记。分析子代△SNP-index，定位到2个与抗病性显著关联区间，分别为Chr.6: 10 082-11 397 kb和Chr.11: 120-266 kb。其中，6号染色体的关联区间与Pi2/9抗病位点等位，区间内含有4006个SNPs和623个插入缺失（InDels）标记；11号染色体的关联区间含有752个SNPs和195个InDels标记。结论 谷丰B对强致病力501-3菌株抗性可能是由第6号和11号染色体上的基因共同控制。研究结果为谷丰B抗性基因的精细定位及基因克隆奠定了基础，并为水稻抗稻瘟病分子标记辅助选择提供标记资源。Abstract:Objective The rice cultivar Gufeng B confers strong, broad-spectrum, durable resistance against various rice blast isolates. The present study was aim to identify and map the blast resistance gene(s) in Gufeng B.Method The F1 and F2 population were obtained by crossing Gufeng B and Nipponbare, and the genetic model of blast resistance was analyzed after inoculating with 7 strains of Magnaporthe grisea. Subsequently, F2 population was used to construct a resistant pool and a sensitive pool respectively, and to map the associated loci via the method of bulked segregation analysis.Result Gufeng B exhibited high resistance to all of the tested strains, such as KJ201, RB22, CHNOS, RB6, 2Y838-1, 501-3 and IR16-1, suggesting that Gufeng B may carry the broad-spectrum and high resistance genes. The F1 progenies from the cross between Gufeng B and Nipponbare conferred resistance against the strains 501-3 and IR16-1, and the segregation ratio of resistance and susceptibility among F2 progenies does not fit 3:1, assuming that the resistance against the strains 501-3 and IR16-1 were controlled by multiple locus in Gufeng B. Whole genome re-sequencing of the two parental lines Gufeng B and Nipponbare identified 1,756,964 SNPs. Calculation results of △SNP-index showed that there were two candidate loci conferring resistance to rice blast disease, which were located at Chr.6: 10,082-11,397Kb, corresponding to the Pi2/9 locus, and Chr.11: 120-266Kb. 4006 SNPs and 623 InDels markers were searched within the interval of Chromosome 6, 752 SNPs and 195 InDels within the corresponding region of Chromosome 11, respectively.Conclusion The resistance of Gufeng B to 501-3 strain may be controlled by two resistance genes on chromosomes 6 and 11. Our results laid the foundation for finely mapping and cloning the resistance genes in Gufeng B, and provided marker resources for molecular marker-assisted selection.
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Keywords:
- Rice /
- blast disease /
- resistance gene /
- Gufeng B /
- bulked segregation analysis
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0. 引言
【研究意义】稻瘟病是水稻最主要病害之一，每年可造成水稻10%～30%减产，严重年份部分稻区甚至出现绝收[1-2]。因此，稻瘟病防治一直是水稻生产和育种的重中之重。长期实践证明，培育和种植抗病水稻品种是防治稻瘟病最经济、安全和有效的措施，而发掘和鉴定稻瘟病抗性基因对于开展水稻抗病育种具有重要意义。【前人研究进展】截至目前，全世界已鉴定了100多个稻瘟病抗性基因，至少24个基因被克隆，包括Pib、Pi-ta、Pi9、Pi2、Piz-t、Pigm、Pid2、Pi37、Pi36、Pik-m、Pi5、Pit、Pid3、Pid3-A4、Pi54、Pish、Pik-p、Pia、Pik、Pi-CO39、Pi25、Pi1、pi21和Pb1等[3-4]，促进了水稻抗稻瘟病分子育种的发展。然而，一方面抗性基因表现出对稻瘟菌生理小种高度专化性，另一方面由于稻瘟菌生理小种存在易变性，抗性基因在利用数年后抗性容易丧失，因此寻找和鉴定更多新的抗性基因一直被植物病理工作者和水稻育种家重视。近年来，兴起一种快速简单的性状定位的方法——混合群体分离分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA），其基于临时（如F1、F2分离群体）或永久群体（如重组自交系、近等基因系）表现出明显差异的个体，通过构建DNA混池进行基因定位。BSA已被应用于水稻质量性状基因[5]和数量性状基因（QTL）[6-7]的定位。【本研究切入点】谷丰B是福建省农业科学院水稻研究所选育的具有广谱、持久抗稻瘟病的优良品种，种植20多年仍表现出稳定抗性[8]。该材料为挖掘广谱持久抗性基因及研究抗性分子机制带来了契机。【拟解决的关键问题】本研究以谷丰B和日本晴分别作为稻瘟病抗病和感病亲本，配制F2代遗传群体，接种稻瘟菌并鉴定表型。依据水稻稻瘟病抗性评价分级标准，选出极端材料构建感、抗池。通过BSA测序分析，初步确定谷丰B抗性基因连锁区间。本研究旨在为谷丰B抗性基因精细定位及基因克隆奠定基础，并为分子标记辅助选择提供标记资源。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
水稻材料谷丰B、福恢838、甬优1号、圭630、福恢718、IR0462和日本晴均由福建省农业科学院生物技术研究所提供。以抗病品种谷丰B为母本和感病品种日本晴为父本，杂交获得F1和F2遗传群体。
稻瘟菌株501-3、KJ201、IR16-1、RB22、RB6、2Y838-1和CHNOS由福建省农业科学院生物技术研究所保存。
1.2 稻瘟病接种鉴定
稻瘟菌接种在燕麦（或米糠）培养基中，25 ℃暗培养5～7 d，随后刮掉表面菌丝并转移至25 ℃光照条件下培养3 d诱导孢子产生，供接种用。
接种试验在福建省农业科学院生物技术研究所寿山实验基地进行，接种方法参考Tian等[3]的方法。水稻幼苗生长至3～4叶龄时，进行人工喷雾接种。接种后接种池覆盖遮光膜密闭24 h，揭开遮光膜后保证棚内相对湿度90%以上，温度24～28 ℃，5～7 d后调查发病情况。
按照国际水稻研究所发布的稻瘟病分级标准进行病级统计[9]，即：高抗——无病斑；抗——有针尖大小棕色斑点；中抗——有圆形至椭圆形灰色斑，褐色边缘，直径约1～2 mm；中感——有典型纺锤状病斑，病斑面积小于叶面积的10%；感病——有典型纺锤状病斑，病斑面积占叶面积的10.1%～50%；高感——有典型纺锤状病斑，病斑面积大于叶面积的50%，甚至全叶枯死。
1.3 谷丰B抗病性遗传分析
谷丰B和日本晴的F1和F2群体接种501-3和IR16-1菌株，并统计F2群体抗病和感病植株分离比，采用χ2测验进行分离比适合度检测。
1.4 极端分离混合池重测序
谷丰B与日本晴F2群体接种501-3菌株后，挑选极端抗病单株和极端感病单株各20株，同时取亲本谷丰B和日本晴各10株，采用CTAB方法提取基因组DNA。分别将各自单株DNA等量混合，利用二代测序技术对2个混合池和两亲本进行20×和10×覆盖度的全基因组测序，测序和数据处理由诺禾致源公司（中国）完成。
参考Liang等[10]的方法计算2个分离池的SNP频率（SNP-index），随后对2个子代SNP-index作差（△SNP-index）。对△SNP-index在各个染色体上的分布进行作图，选取95%置信水平作为筛选的阈值，确定连锁区间。
2. 结果与分析
2.1 谷丰B抗病性鉴定
利用7个稻瘟菌株501-3、KJ201、IR16-1、RB22、RB6、2Y838-1和CHNOS对谷丰B、福恢838、甬优1号、圭630、福恢718、IR0462及日本晴等材料进行人工接种。图1和表1结果显示，谷丰B对7个供试菌株均表现高抗性，福恢838、甬优1号、圭630、福恢718和IR0462水稻材料对501-3、IR16-1、RB6和2Y838-1菌株表现出不同程度的感病。上述结果初步表明，谷丰B基因组中可能携带了广谱高抗稻瘟病基因。
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图 1 不同水稻品种接种501-3菌株表型鉴定Figure 1. Phenotypic identification on rice varieties inoculated with 501-3 blast strain表 1 水稻品种稻瘟病抗性鉴定Table 1. Blast resistance of rice cultivars品种 Varieties 菌株 Strains 501-3 KJ201 IR16-1 RB22 CHNOS RB6 2Y838-1 IR0462 S MR S R MR MS S 福恢838 Fuhui838 S MR S MS R S HS 甬优1号 Yongyou1 S MR S MS R S S 圭630 Gui630 HS S HS S R HS MS 福恢718 Fuhui718 MS R MS R R S S 谷丰B Gufeng B HR HR HR HR HR HR HR 日本晴Nipponbare HS HS HS HS S S HS 注: HR: 高抗; R: 抗病; MR: 中抗; MS: 中感; S: 感病; HS: 高感
Note: HR: Highly resistant; R: Resistant; MS: Moderately resistant; MS: Moderately susceptible; S: Susceptible; HS: Highly susceptible.2.2 谷丰B对稻瘟菌501-3和IR16-1的遗传分析
利用501-3和IR16-1菌株对谷丰B和日本晴的F1和F2群体进行接种，分析谷丰B的抗性遗传模式。结果显示，F1群体对501-3和IR16-1菌株均表现高抗，F2植株出现不同程度抗病和感病。将抗病（包括中抗、抗和高抗）和感病（包括中感、感病和高感）植株的分离比按3:1理论比例进行卡方测验，其对应501-3和IR16-1的χ2值分别为33.09和27.98，均显著大于χ（0.05）2=3.84（表2），推测谷丰B基因组存在多个位点影响稻瘟病抗性。
表 2 谷丰B稻瘟病抗性遗传分析Table 2. Genetic analysis on blast resistance of Gufeng B群体
Population菌株
Strains总株数
Total number抗病株数
Number of resistant plants感病株数
Number of susceptible plants期望比
Expected rationχ2 F1（NPB×谷丰B） 501-3 30 30 0 — — IR16-1 30 30 0 — — F2（NPB×谷丰B） 501-3 407 255 152 3:1 33.09 IR16-1 430 275 155 3:1 27.98 注: NPB: 日本晴; χ2（0.05）=3.84
Note: NPB: Nipponbare; χ2 (0.05)=3.84.2.3 BSA测序和数据分析
基于上述结果，采用BSA方法对20个高感单株和20个高抗单株构建的DNA混合池以及亲本进行全基因组测序，共产生 32.66 G原始数据（Raw data）。过滤后获得32.475 G 有效数据（Clean data），各样本的Clean data在9.880～12.177 G，所有样品Q30≥91.52%，GC含量在44.3%～47.59%；通过与日本晴参考基因组比对，各样品比对率均在95.36%以上，4×覆盖度（至少有4个碱基的覆盖）在87.48%～97.69%（表3）。由此可知，各样本数据量足够，测序质量高，测序数据比对结果正常，可用于后续的变异检测及相关分析。
表 3 过滤后的数据统计表Table 3. Statistics on data after screening样本
Sample有效数据量
Clean Base/G准确度
Q30/%GC含量
GC content/%与参考基因组相同片段
Mapped reads匹配率
Mapped ratio/%覆盖度
Coverage/%谷丰 B 9.88 92.44 44.3 62,811,386 95.36 87.48 NPB ND ND ND 74,123,818 98.18 97.59 抗病池 R pool 12.177 92.44 47.26 77,601,474 95.59 97.69 感病池 S pool 10.417 91.52 47.59 66,943,380 96.39 96.94 将亲本谷丰B和日本晴测序结果比较，共筛选1 756 964个SNPs和409 345个InDels位点，数量足以覆盖到整个基因组；各染色体SNP和InDel分布密度分别在4.037～5.902 个·kb−1和0.967～1.300 个·kb−1（表4）。这些多态性位点可被进一步用于基因的定位及关联分析。
表 4 SNPs和InDels在水稻12条染色体的分布Table 4. Distribution of identified SNPs and InDelsk in 12 chromosomes of rice染色体
Chromosome染色体
长度
Chr. LengthSNPs InDels 数量
Number密度
Density /
（个·kb−1）数量
Number密度
Density/
（个·kb−1）Chr.1 43270923 190273 4.397 46279 1.070 Chr.2 35937250 184278 5.128 42618 1.186 Chr.3 36413819 172550 4.739 42505 1.167 Chr.4 35502694 161349 4.545 31762 0.895 Chr.5 29958434 127664 4.261 30080 1.004 Chr.6 31248787 137688 4.406 35460 1.135 Chr.7 29697621 151268 5.094 34762 1.171 Chr.8 28443022 123316 4.336 28761 1.011 Chr.9 23012720 92893 4.037 22257 0.967 Chr.10 23207287 136960 5.902 30171 1.300 Chr.11 29021106 153785 5.299 33329 1.148 Chr.12 27531856 124940 4.538 31361 1.139 总计Total 373245519 1756964 4.707 409345 1.097 2.4 BSA-Seq鉴定谷丰B抗性基因连锁区间
利用SNP位点分析2个混合池△SNP-index，以95%置信水平作为筛选的阈值进行全基因组扫描。结果（图2）发现，位于第6号和第11号染色体的2个区域出现了超过临界值水平的峰，推测这2个区域为稻瘟病抗性关联区域。其对应日本晴基因组上的位置为Chr.6: 10 082-111 397 kb和Chr.11: 120-266 kb，其中6号染色体的关联区域包含Pi2/9抗病位点，而11号染色体关联区域为新的稻瘟病抗性遗传位点。
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图 2 第6号和第11号染色体关联区间部分区段所对应的物理位置注: 箭头表示超过临界值水平的峰Figure 2. Locations of corresponding regions in Chromosome 6 and Chromosome 11Note: Arrow indicates peak above critical level.为了精细定位谷丰B抗稻瘟病基因，从6号染色体的关联区间筛选出了4 006个SNPs和623个InDels标记，从11号染色体的关联区间筛选出了752个SNPs和195个InDels标记。
3. 讨论与结论
抗谱宽、抗性强且持久的抗源是挖掘抗病基因资源，研究稻瘟病抗性分子遗传机制的理想材料，如谷梅4和子预44。Deng等[11]从谷梅4中鉴定了1个广谱持久抗瘟性新位点Pigm，并系统解析了Pigm持久抗病机制；子预44是一个云南地方粳稻品种，截至目前已从该品种挖掘出抗不同稻瘟病菌株的主效基因Pi-zy（t）、Pi-zy3（t）、Pizy6（t）、Pi-zy4（t）和微效基因[12]。本研究人工接种鉴定结果表明，谷丰B基因组中可能携带了广谱高抗稻瘟病基因。通过抗性遗传分析以及利用BSA-seq方法，鉴定到2个稻瘟病抗性关联位点（分别为Chr.6: 10 082-11 397 kb和Chr.11: 120-266 kb）决定了谷丰B对501-3菌株的抗性。其中，6号染色体关联区域可能和Pi2/9基因座有关，而11号染色体关联区域可能是新的稻瘟病抗性遗传位点。
Pi2/9是公认对稻瘟病抗性育种有重要应用价值的位点，位于水稻第6染色体短臂端。截至目前，已报道该基因座上至少有9个稻瘟病抗性基因（Pi2、Piz、Piz-t、Pi9、Pi40、Pi50、Pi26、Pigm、Pi2-2），其中Pi2、Pi9、Pi50以及Pigm已被成功克隆[11,13-14]。张柱坚等[15]利用抗性基因标记鉴定谷丰B可能存在Pigm、Pi-d2和Pi-d3。结合本研究结果，表明谷丰B对501-3菌株的抗性是由Pigm决定的。但有意思的是，研究发现单独突变Pi-d2或Pigm均能够导致谷丰B丧失对501-3菌株抗性[15]，说明谷丰B的稻瘟病抗性可能受多个位点共同影响。本研究发现一个新的关联区域（Chr.11: 120-266 kb区域）也可能对谷丰B抵抗501-3菌株侵染起关键作用，该区域包含25个水稻基因（数据来源于NCBI数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。深入研究将有助于明确广谱高抗稻瘟病遗传构成及其分子机制。
广谱持久高抗的抗源常作为优良供体材料，应用于抗病分子育种。然而研究人员时常发现在选育过程中培育的新材料相比于原始供体亲本，其抗谱变窄。这种现象的根本原因在于，我们对亲本广谱高抗稻瘟病遗传构成及其内在机制缺乏了解，限制了分子标记辅助选择准确、有效的应用。本研究结果可为后续合理利用谷丰B抗病亲本培育抗病品种提供有效信息。
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图 1 不同水稻品种接种501-3菌株表型鉴定
Figure 1. Phenotypic identification on rice varieties inoculated with 501-3 blast strain
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图 2 第6号和第11号染色体关联区间部分区段所对应的物理位置
注: 箭头表示超过临界值水平的峰
Figure 2. Locations of corresponding regions in Chromosome 6 and Chromosome 11
Note: Arrow indicates peak above critical level.
表 1 水稻品种稻瘟病抗性鉴定
Table 1 Blast resistance of rice cultivars
品种 Varieties 菌株 Strains 501-3 KJ201 IR16-1 RB22 CHNOS RB6 2Y838-1 IR0462 S MR S R MR MS S 福恢838 Fuhui838 S MR S MS R S HS 甬优1号 Yongyou1 S MR S MS R S S 圭630 Gui630 HS S HS S R HS MS 福恢718 Fuhui718 MS R MS R R S S 谷丰B Gufeng B HR HR HR HR HR HR HR 日本晴Nipponbare HS HS HS HS S S HS 注: HR: 高抗; R: 抗病; MR: 中抗; MS: 中感; S: 感病; HS: 高感
Note: HR: Highly resistant; R: Resistant; MS: Moderately resistant; MS: Moderately susceptible; S: Susceptible; HS: Highly susceptible.
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表 2 谷丰B稻瘟病抗性遗传分析
Table 2 Genetic analysis on blast resistance of Gufeng B
群体
Population菌株
Strains总株数
Total number抗病株数
Number of resistant plants感病株数
Number of susceptible plants期望比
Expected rationχ2 F1（NPB×谷丰B） 501-3 30 30 0 — — IR16-1 30 30 0 — — F2（NPB×谷丰B） 501-3 407 255 152 3:1 33.09 IR16-1 430 275 155 3:1 27.98 注: NPB: 日本晴; χ2（0.05）=3.84
Note: NPB: Nipponbare; χ2 (0.05)=3.84.
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表 3 过滤后的数据统计表
Table 3 Statistics on data after screening
样本
Sample有效数据量
Clean Base/G准确度
Q30/%GC含量
GC content/%与参考基因组相同片段
Mapped reads匹配率
Mapped ratio/%覆盖度
Coverage/%谷丰 B 9.88 92.44 44.3 62,811,386 95.36 87.48 NPB ND ND ND 74,123,818 98.18 97.59 抗病池 R pool 12.177 92.44 47.26 77,601,474 95.59 97.69 感病池 S pool 10.417 91.52 47.59 66,943,380 96.39 96.94
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表 4 SNPs和InDels在水稻12条染色体的分布
Table 4 Distribution of identified SNPs and InDelsk in 12 chromosomes of rice
染色体
Chromosome染色体
长度
Chr. LengthSNPs InDels 数量
Number密度
Density /
（个·kb−1）数量
Number密度
Density/
（个·kb−1）Chr.1 43270923 190273 4.397 46279 1.070 Chr.2 35937250 184278 5.128 42618 1.186 Chr.3 36413819 172550 4.739 42505 1.167 Chr.4 35502694 161349 4.545 31762 0.895 Chr.5 29958434 127664 4.261 30080 1.004 Chr.6 31248787 137688 4.406 35460 1.135 Chr.7 29697621 151268 5.094 34762 1.171 Chr.8 28443022 123316 4.336 28761 1.011 Chr.9 23012720 92893 4.037 22257 0.967 Chr.10 23207287 136960 5.902 30171 1.300 Chr.11 29021106 153785 5.299 33329 1.148 Chr.12 27531856 124940 4.538 31361 1.139 总计Total 373245519 1756964 4.707 409345 1.097
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