寒兰是兰科兰属植物，是国兰之一，广泛分布于中国、日本南部、朝鲜半岛南端，我国寒兰主要分布在福建、广东、浙江、广西、江西、湖南、湖北、四川等地^[1-2]。兰花性平、味辛，全草有养阴润肺之疗效，兼治咯血、头晕目眩、神经衰弱、尿道感染等病症^[3]。随着技术的发展进步，兰花的培育规模逐步增大，但是近期市场上盆栽兰花的销售量增长不快，甚至出现不增反减的现象，因此研究兰花功效成分，拓展兰花的利用价值具有重要的意义。黄酮类化合物是兰花中主要功效成分^[4]，可以抗菌、抗炎、抗辐射，降低血糖、胆固醇，改善血液循环，促进伤口愈合和止痛等^[5-9]。在兰花中，总黄酮的提取采用的是较为传统的加热回流提取方法，翟富荣等^[10]采用加热回流的方法对文心兰花和石斛兰花的总黄酮进行提取，加热回流提取时间为2 h，提取时间较长。超声提取方法能加速细胞内有效物质的释放、扩散和溶解，能显著提高提取效率，而且超声提取温度较低，能够避免一些热不稳定物质的损失，提高提取物品质。目前，超声提取方法已广泛应用在总黄酮的提取中，在枇杷花^[11]、刺槐花^[12]、蔷薇花^[13]、石斛花^[14]中均有报道，但是尚未有超声提取寒兰花总黄酮的报道。因此，本文对寒兰花总黄酮超声提取方法进行探讨，建立寒兰花总黄酮超声提取工艺，并进一步通过稳定性、重现性、加样回收率等试验验证工艺的可行性，以期为兰花的功效物质研究和开发利用提供参考依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

寒兰鲜花(福建省连城兰花股份有限公司)。

1.2   试验试剂和仪器

试剂：无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为国产分析纯；芦丁(购自北京索莱宝科技有限公司，含量大于98%)。

仪器：电热鼓风干燥箱(DHG-9240A，上海一恒科学仪器有限公司)；手提式粉碎机(HK-04A，广州市旭朗机械设备有限公司)；电子天平(Denver TP-214，丹佛仪器有限公司)；超声波清洗机(SB-5200DTDN，宁波新芝生物科技股份有限公司)；离心机(Centrifuge5804R，eppendorf公司)；紫外-可见分光光度计(型号：T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.3   试验方法

1.3.1   对照品溶液制备

精密称取对照品芦丁13.4 mg于50 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度线，制成质量浓度为0.268 mg·mL^-1的对照品溶液。

1.3.2   显色反应及测定方法

参照郑菲艳等^[15]的方法，取适量测定溶液于5 mL试管中，加入0.3 mL的5%亚硝酸钠溶液，混合均匀，静置6 min；加入0.3 mL的10%硝酸铝溶液，混合均匀，静置6 min；加入2 mL的4%氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容至刻度线，混合均匀，静置10 min，于510 nm处测定其吸光度。

1.3.3   标准曲线的绘制

分别移取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL的对照品溶液按照1.3.2的显色及测定方法进行测定，以吸光值为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.4   样品溶液的制备及测定

将新鲜寒兰花材料置于60℃烘箱中，烘干至恒重后，用手提式粉碎机打成粉末(80目)；取适量粉末置于离心管中，加入一定比例和浓度的乙醇溶液，混合均匀，静置10 min；将静置完的样品超声提取(40℃)一定时间，在10 000 r·min^-1下离心5 min，取上清液即为样品溶液；取样品溶液按照1.3.2的显色及测定方法进行测定，得到样品溶液的吸光值，并对其含量进行计算^[16]。

式中：W为样品总黄酮的得率/%；C为待测样品总黄酮的质量浓度/(mg·mL^-1)；V为待测液体积/mL；n为稀释倍数；m为寒兰花质量/g。

1.3.5   寒兰花总黄酮提取单因素试验

参照郑菲艳等^[15]的试验方法，设计了3个单因素试验。固定提取溶剂为70%乙醇、超声提取时间20 min(超声频率40 kHz，下同)，料液比分别为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50；固定料液比1:20、超声提取时间20 min，提取溶剂分别为50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇；固定料液比1:20、提取溶剂为70%乙醇，超声提取时间分别为10、20、30、40、50 min。每个处理重复3次。

1.4   数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0软件设计因素水平表，并进行方差分析，采用GraphPad Prism 5软件进行作图。

2.   结果与分析

2.1   寒兰花总黄酮提取单因素试验及分析

2.1.1   料液比对寒兰花总黄酮提取的影响

称取0.1 g寒兰花粉末，分别按照料液比为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50加入70%的乙醇，超声提取20 min，测定不同料液比下的寒兰花总黄酮的得率，结果见图 1。

图  1  料液比对寒兰花总黄酮提取的影响

注：图中不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。图 2、3同。

Figure  1.  Effect of solid:liquid ratio on flavonoid extraction rate from C. kanran flowers

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由图 1可以看出，随着料液比的增加寒兰花总黄酮的提取率先增加，后有稍微下降，通过方差分析得出料液比1:10时的黄酮得率显著低于其他料液比的黄酮得率，料液比1:20到1:50之间黄酮的得率没有显著性的差异，可见单因素试验中提取寒兰花总黄酮的料液比选择1:20为宜，因此正交试验的料液比选择1:10、1:20和1:30。

2.1.2   乙醇体积分数对寒兰花总黄酮提取的影响

称取0.1 g寒兰花粉末，按照料液比为1:20分别加入体积分数为50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇，超声提取20 min，测定不同乙醇体积分数下的寒兰花总黄酮的得率，结果见图 2。

图  2  乙醇体积分数对寒兰花总黄酮提取的影响

Figure  2.  Effect of alcohol concentration on flavonoid extraction rate from C. kanran flowers

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由图 2可以看出，乙醇从50%到90%，随着乙醇体积分数的增加，寒兰花总黄酮的得率也在升高，经过方差分析可以得出90%乙醇提取的黄酮得率显著高于其他浓度提取的黄酮得率。可见单因素试验中提取寒兰花总黄酮的乙醇选择90%乙醇为宜，因此正交试验的乙醇选择70%、80%、90%的乙醇。

2.1.3   超声时间对寒兰花总黄酮提取的影响

称取0.1 g寒兰花叶粉末，按照料液比为1:20加入70%的乙醇，分别超声提取10、20、30、40、50 min，测定不同超声提取时间下的寒兰花总黄酮的得率，结果见图 3。

图  3  超声时间对寒兰花总黄酮提取的影响

Figure  3.  Effect of ultrasound application time on flavonoid extraction rate from C. kanran flowers

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由图 3可以看出，超声时间在10~50 min对于寒兰花总黄酮的提取率几乎没有影响，经过方差分析得出超声时间在10~50 min提取的寒兰花总黄酮得率没有显著性差异，可见单因素试验中提取寒兰花总黄酮的超声时间选择10 min为宜，因此正交试验的超声时间选择10、20、30 min。

2.2   寒兰花总黄酮提取正交试验

在单因素试验的基础上，综合考察料液比、乙醇体积分数和超声时间这3个因素之间的相互影响，探讨其对寒兰花总黄酮提取的影响，每个因素设计3个水平(表 1)，进行L₉(3⁴)正交试验。

表  1  因素水平

Table  1.  Factors and levels of orthogonal experiment

水平	料液比/(g·mL-1)	乙醇体积分数/%	超声时间/min
1	1:20	70	10
2	1:30	80	20
3	1:40	90	30

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结合表 2和表 3可以看出，对于寒兰花总黄酮的提取率的影响排序是：乙醇体积分数>料液比>超声时间，且乙醇体积分数对于黄酮的提取率的影响具有显著性，料液比和超声时间对黄酮的提取率没有显著影响。因此，得出寒兰花总黄酮的最佳提取条件为A₁B₃C₁，即提取料液比为1:20，乙醇体积分数为90%，超声时间为10 min。

表  2  寒兰花总黄酮提取的正交试验结果与分析

Table  2.  Orthogonal test results and analysis

编号	因素				黄酮得率/%
	料液比	乙醇体积分数	超声时间	空列
1	1	1	1	1	1.2085
2	1	2	2	2	1.3878
3	1	3	3	3	1.8538
4	2	1	2	3	1.2217
5	2	2	3	1	1.5571
6	2	3	1	2	1.9470
7	3	1	3	2	1.3492
8	3	2	1	3	1.5849
9	3	3	2	1	2.1172
K1	4.4500	3.7794	4.7673	4.8828
K2	4.7529	4.5298	4.7267	4.7110
K3	5.0512	5.9450	4.7600	4.6604
k1	1.4833	1.2598	1.5891	1.6276
k2	1.5843	1.5099	1.5756	1.5703
k3	1.6837	1.9817	1.5867	1.5535
极差R	0.2004	0.7219	0.0111	0.0741

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表  3  方差分析

Table  3.  Analysis of variance

因素	偏差平方和	自由度	方差	F值	显著性
A	6.0230×10-2	2	3.0115×10-2	6.6470	-
B	0.8062	2	0.4031	88.9715	*
C	3.1306×10-4	2	1.5653×10-4	0.0345	-
注：F0.05(2，2)=19，当F>19说明有显著性意义，*P < 0.05。

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2.3   最佳条件验证试验

按照正交试验得到的最佳提取条件进行3次重复试验，即称取寒兰花粉末0.05 g，按1:20的料液比加入90%乙醇溶液，超声提取10 min，测定寒兰花总黄酮的得率，结果见表 4，该工艺条件下寒兰花总黄酮得率为2.055 4%，RSD为1.85%，小于5%，说明该工艺稳定可行。

表  4  验证试验

Table  4.  Verification tests

反应条件	试验序号	黄酮得率/%
A1B3C1	1	2.0331
	2	2.0993
	3	2.0338
	平均值	2.0554

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2.4   重现性试验

按照最佳条件提取6次，测得吸光值，结果见表 5，RSD值为3.03%，说明该方法重现性良好。

表  5  重现性试验结果

Table  5.  Repeatability test result

编号	1	2	3	4	5	6	平均值	RSD/%
吸光值	0.5204	0.5016	0.5184	0.5004	0.4900	0.4820	0.5021	3.03

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2.5   稳定性试验

按照最佳提取条件提取完样品，显色完全后，每隔20 min测定吸光值1次，连续测定2 h，结果见表 6，RSD值为0.85%，说明该方法在2 h内稳定性良好。

表  6  稳定性试验结果

Table  6.  Stability test result

编号	1	2	3	4	5	6	7	平均值	RSD/%
吸光值	0.4820	0.4876	0.4872	0.4828	0.4824	0.4752	0.4832	0.4829	0.85

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2.6   加样回收试验

在已知浓度的供试溶液中加入适量的标准品，进行显色反应，测定加入标准品的回收率，结果见表 7，回收率为98.10%~100.20%，平均回收率为99.35%，由于试验中存在操作和机器的误差，该回收率属于可接受的范围，RSD值为1.17%，说明该方法测定的结果准确可靠。

表  7  加样回收试验

Table  7.  Recovery test result

编号	加入量/μg	回收率/%	平均回收率/%	RSD/%
1	13.4	99.75	99.35	1.17
2	26.8	100.20
3	40.2	98.10

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3.   讨论与结论

本研究中寒兰花总黄酮的最佳提取溶剂为90%乙醇，当乙醇体积分数为50%~90%时，随着乙醇体积分数的增加，黄酮得率呈现出增加的趋势，当乙醇体积分数达到100%时，黄酮的得率又下降了，这与前人提取文心兰花和石斛兰花总黄酮时的研究结果^[10]一致，这主要是由物质相似相溶和乙醇体积分数升高渗透性增强共同作用造成的。

翟富荣等^[10]的研究中，采用加热回流的方法对文心兰花和石斛兰花的总黄酮进行提取，总黄酮得率分别为2.18%和1.81%，加热回流提取时间为2 h，本研究中寒兰花总黄酮得率为2.055 4%，超声提取时间10 min即可，可见与传统的加热回流提取方法相比，超声提取方法极大地缩短了提取时间。

本研究以寒兰花为原料，对超声提取总黄酮的工艺进行研究，通过单因素试验方法分析料液比、乙醇体积分数和超声时间对寒兰花总黄酮超声提取的影响，综合考虑因素间的相互作用，进一步采用L₉(3⁴)正交试验对超声提取寒兰花总黄酮的工艺进行研究，最终确定寒兰花总黄酮的最佳提取条件为料液比1:20，乙醇体积分数90%，超声时间10 min，寒兰花总黄酮得率为2.055 4%，通过重现性试验、稳定性试验和加样回收试验，确定该提取工艺准确稳定。本研究为兰花总黄酮的提取方法提供参考依据，促进兰花的开发利用。