Remediation Effect of Biological Agents on Rhizosphere Soil on Land of Continuously Cropped Panax notoginseng
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摘要: 本研究探讨有益微生物复合菌剂（Effective Micoorganisms，EM）与木霉菌剂（Trichoderma，TRI）对三七连作障碍的消减作用及其作用机理。结果表明：EM和TRI处理的重茬三七出苗率、保苗率、产量均显著提高；EM处理的重茬土壤中的各营养指标均有所提高，TRI处理的重茬土壤中的速效钾等营养指标显著提高；HPLC分析发现，重茬三七根际土壤的酚酸含量未出现累积效应，可见三七连作障碍的发生并非是由化感物质的直接作用造成的，可能与化感物质对根际环境的间接作用有关；变性梯度凝胶电泳（DGGE）、荧光定量PCR（qRT-PCR）原位分析验证结果发现两种菌剂处理均能使连作土壤中的有益菌含量增加，有害菌含量减少，其中TRI的处理效果更为显著。说明这两种菌剂处理均可有效修复三七根际土壤，缓解连作障碍，同时显著提高三七产量，达到了预期效果。Abstract: Two biological agents, EM and TRI, were applied in soil on a continuous cropping field of Panax notoginseng to study the remediating effect on the soil and the mechanism associated with the application. Treatments with the agents were found significantly increased the seedling emergence rate and survival rate as well as the root yield. All nutrients in the soil treated with EM were increased, while the available potassium in the soil treated with TRI significantly improved. The HPLC analysis showed no accumulation of phenolic acids in the rhizosphere soil by these treatments indicating that allelochemicals were not directly, but might indirectly, involved in the detrimental effect on P. notoginseng caused by continuous cropping. The DGGE and qRT-PCR test results showed that both EM and TRI, especially TRI, could increase the population of beneficial, while depressed the harmful, bacteria in the soil. Thereby, the rhizosphere soil was effectively repaired by alleviating the deficiency brought about by the continuous cropping practice, and consequently, the growth and yield of P. notoginseng was significantly recovered or improved.
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我国是柚类种植大国，琯溪蜜柚是我国柚类栽培面积第二大良种，年产量约占全国柚类的35%[1]。福建漳州平和县是全国最大的柚类商品生产基地和出口生产基地，被誉为“中国柚都”和“世界柚乡”[2]。琯溪蜜柚作为平和县最大宗的农产品，已成为平和县农业的优势产业、农业主导产业、农村经济支柱产业、农业名牌产品、农民经济收入的主要来源[3]。琯溪蜜柚属于区域性、季节性明显的水果，采后保鲜期有限，近几年出口市场的开拓，带动琯溪蜜柚市场收购价格的持续上扬，琯溪蜜柚种植区域及产量逐年提高，将琯溪蜜柚进行深加工的意义越来越突出[4]。但是琯溪蜜柚榨汁后的果汁存在明显的苦味，严重限制琯溪蜜柚的深加工开发，其果汁加工中脱苦技术问题已成为目前该领域的研究热点[5]。
研究表明，柚皮苷naringin和柠檬苦素limonin是琯溪蜜柚果汁的主要苦味物质，黄酮类化合物柚皮苷属于前苦味物质，而三萜系化合物柠檬苦素属于后苦味物质[6-7]。据相关文献报道，目前柚类果汁主要采用的脱苦方法有β-环糊精包埋法[8]、树脂或活性炭等吸附法[9-10]、酶法[11]、加热法、膜过滤法、超临界CO2萃取法等多种物理脱苦和代谢脱苦法等[12], 其中吸附法等物理脱苦法因操作简单而普遍应用于柚类果汁工业化生产中，但同时也不可避免附带去除了柚汁中的营养保健成分和风味物质[13]。水解酶能够酶法分解琯溪蜜柚果汁中的主要苦味分子，代谢成苦味较弱或无苦味的其他分子，相对于物理脱苦法，酶法脱苦因其专一性强且条件温和、对柚汁的营养保健成分和风味物质的影响或改变较小、成本低等优点，在琯溪蜜柚果汁加工上具有广阔的产业化应用前景。在前期研究中，本课题组建立了高效液相色谱法同时测定柚皮苷、柠檬苦素含量方法，本研究在此基础上，以琯溪蜜柚果汁为对象，研究在不同酶解条件下柚苷酶naringinase对琯溪蜜柚果汁的脱苦效果及其主要营养成分和风味的影响，旨在为脱苦柚类果汁的规模化生产提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料和试剂
供试蜜柚为福建平和县产的新鲜的琯溪蜜柚。
柚苷酶制剂(酶活10 000 U·g-1)：河南豫中生物科技有限公司；柚皮苷(色谱纯)：上海安谱实验科技股份有限公司；柠檬苦素(色谱纯)：Sigma公司；维生素C(色谱纯)：德国DR公司；乙腈(色谱纯)：Merck公司；分析纯试剂：国药集团化学试剂有限公司。试验用水为超纯水。
1.2 试验仪器和设备
高效液相色谱仪L-2000型，日本Hitachi公司；恒温水浴锅上海宝磊仪器有限公司；台式酸度计PB-10型；飞利浦榨汁机；美的电磁炉；电子天平AR2140，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；手持折射仪MASTER-53a；高速冷冻离心机GL-20G-II型。
1.3 样品制备和测定方法
1.3.1 鲜琯溪蜜柚汁的制备
将琯溪蜜柚果实去除皮层、囊衣和柚籽，将果肉用打浆机榨汁过滤，5 000 r·min-1离心10 min得鲜琯溪蜜柚汁，于80℃下巴氏杀菌30 min得鲜柚汁。
1.3.2 柚皮苷和柠檬苦素提取液的制备
酶解后的果汁通过沸水浴灭活20 min后，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液5 mL，用乙腈定容至10 mL容量瓶中，超声处理10 min，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤后，利用HPLC同时测定样品中柚皮苷和柠檬苦素含量[14]。
1.3.3 柚皮苷和柠檬苦素标准溶液的配制
将柚皮苷和柠檬苦素标准品分别溶解于乙腈中，配制成1 mg·mL-1的柚皮苷标准品母液和2 mg·mL-1柠檬苦素标准品母液，-20℃保存备用，使用时按需要用乙腈稀释成适当的质量浓度。
1.3.4 柠檬苦素和柚皮苷的检测方法
采用HPLC法同时测定柠檬苦素和柚皮苷含量[15]：分别以柚皮苷标准品和柠檬苦素标准品为标准样，色谱条件如下，色谱柱为美国Welch公司Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm；5 μm)；检测器为DAD二极管阵列；流动相：乙腈-0.1%TFA(3:1, v·v)；流速：1 mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：柠檬苦素在210 nm，柚皮苷在280 nm；进样体积：10 μL。以标样出峰时间定性，外标法峰面积定量。采用梯度洗脱，洗脱程序见表 1。
表 1 3种检测方法的比较Table 1. Comparison of three methods时间/min 0 15 15.1 20 乙腈/% 30 60 60 60 0.1%TFA 70 40 40 40 1.3.5 琯溪蜜柚汁其他分析方法
维生素C的测定：参照张秀梅等[16]的方法；采用HPLC法测定琯溪蜜柚汁中维生素C含量，分别以维生素C标准品为标准样，色谱条件如下，色谱柱为美国Welch公司Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm；5 μm)；检测器为DAD二极管阵列；流动相：0.2%偏磷酸水溶液；流速：1 mL·min-1；柱温：35℃；检测波长：240 nm；进样体积：10 μL。pH值用pH计测定；
1.4 数据分析
柚苷酶对琯溪蜜柚汁酶解处理的脱苦能力以琯溪蜜柚汁中苦味物质柚皮苷和柠檬苦素的去除率和维生素C的损失率表示，即：
柚皮苷/柠檬苦素去除率/%=(C0-C1)/C0×100%；VC损失率/%=(V0-V1)/V0×100%；VC保持率/%=V1/V0；VC损失率+VC保持率=1。
式中：C0为没有添加柚苷酶的空白组的琯溪蜜柚汁中柚皮苷/柠檬苦素含量/(μg·mL-1); C1为添加柚苷酶经酶解反应后柚汁的柚皮苷/柠檬苦素含量/(μg·mL-1); V0为没有添加柚苷酶的空白组的琯溪蜜柚汁中VC含量/(μg·mL-1); V1为添加柚苷酶经酶解反应后柚汁的VC含量/(μg·mL-1)。
在柚苷酶的酶解作用下，琯溪蜜柚汁中柚皮苷和柠檬苦素含量去除率越高，且维生素C的损失率越低，表示维生素C的保持率就越高，其酶解脱苦的效果越好。
1.5 试验方法
1.5.1 柚苷酶添加量对琯溪蜜柚汁脱苦效果和营养风味的影响
以pH自然琯溪蜜柚汁加热至45℃，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g·L-1等不同的柚苷酶添加量进行水浴酶解1 h为试验因素进行单因素试验。以降低苦味物质柠檬苦素和柚皮苷，并保留维生素C为目的，研究筛选出最适于琯溪蜜柚汁脱苦工艺的柚苷酶添加量。
1.5.2 酶解温度对琯溪蜜柚汁脱苦效果和营养风味的影响
以pH自然琯溪蜜柚汁，加入0.7 g·L-1的柚皮苷酶，分别在35、40、45、50、55℃等不同的酶解温度下进行水浴酶解1 h为试验因素进行单因素试验。以降低苦味物质柠檬苦素和柚皮苷，并保留维生素C为目的，研究筛选出最适于琯溪蜜柚汁脱苦工艺的酶解温度。
1.5.3 酶解时间对琯溪蜜柚汁脱苦效果和营养风味的影响
以琯溪蜜柚汁加热至45℃，加入0.7 g·L-1的柚皮苷酶、pH自然，分别在0、0.5、1、1.5、2 h等不同的酶解时间下进行水浴酶解为试验因素进行单因素试验。以降低苦味物质柠檬苦素和柚皮苷，并保留维生素C为目的，研究筛选出最适于琯溪蜜柚汁脱苦工艺的酶解时间。
1.5.4 琯溪蜜柚汁的pH值对琯溪蜜柚汁脱苦效果和营养风味的影响
以琯溪蜜柚汁加热至45℃，加入0.7 g·L-1的柚皮苷酶，分别在3.0、3.5、4.0、4.5、5.0等不同的琯溪蜜柚汁pH值下进行水浴酶解1 h为试验因素进行单因素试验。以降低苦味物质柠檬苦素和柚皮苷，并保留维生素C为目的，研究筛选出最适于琯溪蜜柚汁脱苦工艺的琯溪蜜柚汁pH条件。
1.5.5 酶解脱苦的正交试验优化
在单因素试验的基础上，选取酶用量、酶解时间、酶解温度、果汁pH值作为正交试验因素和3个水平，进行L9(34)正交试验，以柚皮苷、柠檬苦素和维生素C含量为考查指标，综合考虑脱苦效果及对营养成分的保留能力，优化酶法脱苦的工艺条件参数。
2. 结果与分析
2.1 酶添加量对果汁脱苦效果的影响
不同柚苷酶添加量对蜜柚汁中柚皮苷、柠檬苦素和维生素C含量变化的影响，试验结果(图 1)显示，柚皮苷和柠檬苦素的去除率与柚苷酶的添加量呈显著正相关，随着柚苷酶添加量的增大，琯溪蜜柚汁中的主要苦味物质被逐步水解，柚皮苷和柠檬苦素的去除率大幅上升；当柚苷酶的添加量在0.6~0.8 g以后，蜜柚汁中的苦味物质去除率增加缓慢；当添加1.0 g以上的柚苷酶进行脱苦，发现基本感官品尝不出苦味，果汁出现混浊，但琯溪蜜柚特有的风味损失较大。柚苷酶的添加对蜜柚汁中的维生素C含量的损失不显著。因此，综合考虑柚苷酶用量的成本和琯溪蜜柚汁中感官风味，最适于琯溪蜜柚汁脱苦工艺的柚苷酶添加量在0.6~0.8 g。
2.2 酶解温度对琯溪蜜柚汁脱苦效果和营养风味的影响
不同酶解温度对蜜柚汁中柚皮苷、柠檬苦素和维生素C含量变化的影响，试验结果(图 2)显示，蜜柚汁中的柠檬苦素、柚皮苷和维生素C含量变化受酶解温度的影响较大，随着酶解温度的增大，琯溪蜜柚汁中的主要苦味物质的去除率先缓慢增大后快速变小，维生素C的损失率越来越高。酶解温度从35℃升高到45℃，柚苷酶的活性随着温度的升高而逐渐发挥酶解作用，维生素C的损失率缓慢增加，即脱苦效果越来越好。酶解温度高于50℃后，柚皮苷和柠檬苦素的去除率都出现快速下降，维生素C的损失率持续增加，即脱苦效果变差；这可能是因为部分的柚苷酶变性失活，柚皮苷的去除率受到影响；而柠檬苦素属于“后苦味”物质，在酸性条件下，温度越高反而会促使果汁中的其他化合物转变成柠檬苦素，因此柠檬苦素的去除率反而降低。因此，综合考虑苦味物质的去除率和维生素C的损失率，最适于琯溪蜜柚汁脱苦工艺的酶解温度在40~50℃。
2.3 酶解时间对琯溪蜜柚汁脱苦效果和营养风味的影响
不同酶解时间对蜜柚汁中柚皮苷、柠檬苦素和维生素C含量变化的影响，试验结果(图 3)显示，在0.5~1.0 h的酶解水浴时间内，琯溪蜜柚汁中的柚皮苷和柠檬苦素的去除率快速增加；酶解处理时间大于1 h，蜜柚汁中的柚皮苷去除率缓慢增加后趋于平缓，这是因为在柚苷酶的作用下，水解过程是先将柚皮苷转成普鲁宁(有苦味)，最后转化成柚皮素(naringenin，无苦味)[17]，因此酶解作用时间需要稍微延长些；当酶解时间为1.5 h，蜜柚汁中的柠檬苦素去除率达到最大；随着酶解时间的继续延长，其柠檬苦素去除率开始下降，这可能是因为长时间加温蜜柚汁，导致果汁中其他物质转成后苦味物质柠檬苦素。综合考虑蜜柚汁中的维生素C含量随着酶解作用时间的延长而缓慢损失，最后确定最佳的琯溪蜜柚汁酶解时间为1.0~1.5 h。
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图 3 不同酶解时间添加量对柚汁脱苦效果的影响Figure 3. Effect of enzymatic treatment duration on de-bitteringpomelo juice2.4 琯溪蜜柚汁的pH值对琯溪蜜柚汁脱苦效果和营养风味的影响
由图 4可知，柚苷酶水解脱苦效果同样也受蜜柚汁pH值的影响，蜜柚汁pH值在3.0~3.5的范围内呈正相关，说明柚苷酶适于在偏酸环境下发挥水解活性；随着蜜柚汁pH值酸性的逐渐减弱，脱苦效果变差；其中蜜柚汁中的柚皮苷去除率比柠檬苦素的去除率降低的更快，这可能是因为柚皮苷在弱酸性环境下的稳定性比柠檬苦素的好[18]；同时，蜜柚汁中的维生素C在酸性环境下的损失率较小，能较好地保留琯溪蜜柚汁的酸甜风味。因此，综合考虑蜜柚汁中的营养物质维生素C含量、主要苦味物质的去除率及其风味，最后确定最佳的琯溪蜜柚汁pH值在3.5~4.0。
2.5 最佳配方确定
由表 2正交试验结果分析表明，柚苷酶对蜜柚汁中的柚皮苷去除率影响因素的主次顺序为A＞B＞D＞C，即添加柚苷酶量对去除柚皮苷的影响最大，其次是酶解处理温度和蜜柚汁pH汁环境明显大于酶解处理时间，极差分析得到的最佳水平组合为A3B2C1D2；柚苷酶对蜜柚汁中的柠檬苦素去除率影响因素的主次顺序为B＞D＞A＞C，说明酶解处理温度影响最大，其次是蜜柚汁pH值、添加柚苷酶量、酶解处理时间，极差分析得到的最佳水平组合为A3B2C3D2；对比发现柚皮苷与柠檬苦素去除率的最佳水平组合的差异在于酶解处理时间的长短，而酶解处理时间对柚苷酶作用蜜柚汁脱苦效果的影响最小，故选择酶解处理时间1 h即可。
表 2 正交试验设计及结果Table 2. Design and results of orthogonal test试验号 因素 柚皮苷去
除率/%柠檬苦素去
除率/%维生素C保
持率/%A(酶添加量)/g B(酶解温度)/℃ C(酶解时间)/h D(蜜柚汁pH值) 1 1(0.6) 1(40) 1(1.00) 1(3.50) 72.18 53.47 87.23 2 1 2(45) 2(1.25) 2(3.75) 82.06 73.98 88.09 3 1 3(50) 3(1.50) 3(4.00) 73.48 66.63 82.84 4 2(0.7) 1 2 3 76.81 56.14 80.11 5 2 2 3 1 83.56 70.97 87.34 6 2 3 1 2 84.56 72.17 86.20 7 3(0.8) 1 3 2 87.69 74.52 86.35 8 3 2 1 3 88.54 86.43 87.41 9 3 3 2 1 85.93 62.13 79.84 柚皮苷去除率分析 柠檬苦素去除率分析 维生素C保持率分析 k1 75.907 78.893 81.760 64.693 61.377 70.690 86.053 84.563 86.947 k2 81.643 84.720 81.600 66.427 77.127 64.083 84.550 87.613 82.680 k3 87.387 81.323 81.577 74.360 66.977 70.707 84.533 82.960 85.510 R 11.480 5.827 0.183 9.667 15.750 6.623 1.520 4.653 4.267 最优组合 A3B2C1D2 A3B2C3D2 A1B2C1D2 因素主次 A>B>D> CB>D>A>C B>C>D>A 综合考虑柚苷酶对蜜柚汁中的维生素C保持率影响因素的主次顺序为B＞C＞D＞A，说明酶解处理温度影响最大，其次是酶解处理时间、蜜柚汁pH值、添加柚苷酶量，极差分析得到的最佳水平组合为A1B2C1D2；对比发现维生素C保持率与主要苦味物质去除率的最佳水平组合的差异在于柚苷酶用量的不同，而柚苷酶添加量对蜜柚汁中的维生素C保持率的影响最小，故柚苷酶的最佳脱苦条件组合为：A3B2C1D2，即柚苷酶添加量为0.8 g、酶解温度为45℃、酶解时间1 h、初始pH值为3.75(约蜜柚原汁pH值)。
3. 讨论与结论
目前针对酸性果汁类饮料的研究主要集中在探讨果汁饮料生产中的出汁率、苦味去除和悬浮稳定性等问题。其中有关苦味去除的文献中，徐国良等[19]研究了采用活性炭对浓缩橙汁的脱苦效果及果汁品质的影响。许键等[20]利用响应面法对酶法澄清瑁溪蜜柚汁工艺进行优化。陈红等[21]利用棘孢曲霉对柚皮进行固态发酵，将其产生的柚苷酶应用在柑橘果汁脱苦中，能较好地水解柚汁中的柚皮苷。酶法脱苦在柑橘类水果的加工中具有广泛的应用前景，本试验利用柚苷酶对琯溪蜜柚汁进行酶法脱苦试验研究，脱苦效果良好，结果表明：通过分别对酶添加量、琯溪蜜柚汁pH值、酶解温度和时间进行了单因素试验及正交试验，试验优化脱苦条件。结果表明，添加0.8 g柚苷酶至自然pH值的琯溪蜜柚原汁中，在45℃温度下水浴1 h能达到最佳的脱苦效果，同时极大保留了琯溪蜜柚汁的营养成分。在此条件下处理的蜜柚汁中的柚皮苷去除率为90.25%、柠檬苦素去除率为87.09%、维生素C损失率为11.33%。
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图 1 混合酚酸与土样酚酸HPLC出峰
注：1为没食子酸；2为香豆酸；3为丁香酸；4为香兰素；5为阿魏酸；6为苯甲酸。
Figure 1. HPLC on mixed and soil phenolic acids samples
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图 2 不同处理下的三七出苗率、保苗率及产量
Figure 2. Seedling emergence and survival rate and root yield of P. notoginseng under treatments
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图 3 不同处理下连作三七根际土壤酚酸含量
Figure 3. Phenolic acids in rhizosphere soil of P. notoginseng under monoculture regime
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图 4 不同处理三七根际土壤DGGE图谱
注：A为TRI；B为CK；C为NP-DP；D为NP；E为SP；F为EM。
Figure 4. DGGE profile of rhizosphere soil of P. notoginseng under treatment
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图 5 DGGE数据主成分分析(PCA)及聚类分析
Figure 5. Principal component and clustering analyses on DGGE data
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图 6 不同处理下连作三七根际土壤中部分特异菌群含量的原位qRT-PCR分析
注：①A为Anteholosticha gracilis，B为Scutellospora savannicola，C为Anteholosticha manca，D为Trichoderma harzianum，E为Thermococcus barophilus，F为Monacrosporium janus，G为Paraphaeosphaeria verruculosa，H为Geminibasidium donsium，I为Pleosperales，J为Sphaerobolus iowensis。②图中数据为每克鲜土中的特异菌含量。
Figure 6. In situ qRT-PCR analysis on population of specific microbial flora in rhizosphere soil of monocultured P. notoginseng under different treatments
表 1 不同处理对连作三七根际土壤中营养元素含量的影响
Table 1 Effect of treatments on soil nutrient content in monocultured P. notoginseng rhizosphere soil
处理 全氮/(g·kg-1) 全磷/(g·kg-1) 全钾/(g·kg-1) 碱解氮/(mg·kg-1) 速效磷/(mg·kg-1) 速效钾/(mg·kg-1) pH CK 1.29±0.80a 0.22±0.01c 0.75±0.06e 112.58±4.40a 29.54±0.32b 140.83±2.55b 6.49±0.03b NP 0.66±0.83c 0.22±0.01c 3.66±0.06c 42.58±11.65b 24.84±0.12d 155.87±2.55a 6.72±0.11a NP-DP 1.01±0.89b 0.25±0.02b 0.95±0.09d 109.67±9.95a 34.65±0.11a 125.25±1.67c 6.43±0.05b SP 0.22±0.84d 0.12±0.01d 3.57±0.07c 18.08±1.01d 22.70±0.21f 41.75±1.67f 6.03±0.05c EM 0.29±0.90d 0.14±0.01d 4.07±0.08a 20.42±2.02cd 23.72±0.18e 57.34±0.96e 5.95±0.02c TRI 0.58±0.35c 0.37±0.01a 3.83±0.10b 32.67±9.63bc 26.80±0.64c 109.11±0.96d 6.72±0.15a 注：①CK为空白对照；NP为头茬；NP-DP为头茬发病；SP为重茬未处理；EM为有益微生物处理；TRI为木霉菌剂处理。②同列数据后不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。表 2同。 
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表 2 不同根际土壤微生物多样性指数
Table 2 Microbial diversity index of rhizosphere soil under treatments
处理 SIMPSON(J) SHANNON(H) 均匀度 BRILLOUIN McIntosh(Dmc) CK 1.0540c 4.313c 0.992a 3.014a 1.131c NP 1.056b 4.407b 0.988b 2.615bc 1.138b NP-DP 1.060a 4.482a 0.990ab 2.740ab 1.149a SP 1.049d 4.221d 0.988b 2.896bc 1.118d EM 1.056bc 4.362b 0.993a 2.699bc 1.136bc TRI 1.042e 4.056e 0.992a 3.010a 1.100e
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表 3 部分特异条带BLAST比对结果
Table 3 BLAST on specific bands
编号 真菌拉丁名 中文名 A1 Anteholosticha gracilis A2 Trichoderma harzianum 哈茨木霉菌 A3 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 A4 Anteholosticha manca A6 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 A9 Pleosperales 格孢腔菌目 B1 Bryum arcticum 极地真藓 B2 Pleosporales 格孢腔菌目 B3 Ignatius tetrasporus 伊格内修斯子囊菌 C1 Anteholosticha gracilis C2 Pleosperales 格孢腔菌目 C4 Bryum arcticum 极地真藓 D1 Bryum arcticum 极地真藓 D2 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 D3 Entrophospora 稀有内养囊霉 E1 Pleosperales 格孢腔菌目 E2 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 E4 Sphaerobolus iowensis 弹球菌属 E5 Ignatius tetrasporus 伊格内修斯子囊菌 F1 Thermococcus barophilus 嗜热球菌属 F2 Monacrosporium janus 两栖单顶孢菌 F3 Ignatius tetrasporus 伊格内修斯子囊菌 F4 Paraphaeosphaeria verruculosa F6 Geminibasidium donsium F7 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 注：每个菌种比对结果同源性均在98%以上。
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