Optimized Extraction of Functional Ingredients from Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.by Box-Behnken Design
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摘要: 为研究裸花紫珠浸膏得率、总黄酮、总酚酸及总皂苷的最佳提取工艺，以浸膏得率和有效成分总含量（总黄酮、总酚酸及总皂苷含量之和）的加权评分值（加权评分值=浸膏得率×0.7+总有效成分含量×0.3）为指标，通过单因素和响应面设计相结合的方法，以提取方法、提取时间、料液比、乙醇浓度、提取次数为考察因素，优化裸花紫珠有效成分提取工艺。结果表明裸花紫珠有效成分的最佳提取工艺为：超声提取时间为42 min，料液比1：17，乙醇体积分数为62%，提取2次。此条件下加权评分值为119.27，预测加权评分值为120.47，两者相差较小。优化后的裸花紫珠有效成分提取工艺简单可行，重现性和可预测性较好。Abstract: To optimize the extraction of functional ingredients from the leaves of Callicarpa nudiflora Hook. et Arn., an experiment based on the Box-Behnken design was conducted. The extraction rate and contents of functional ingredients including flavonoids, phenolic acids, and saponins in the resulting extracts were weighed against the method, duration, cycle, material to solvent ratio, and ethanol concentration of the process. The weighted value for evaluation was calculated by the formula of(dry weight extract 0.7+ combined weight of functional ingredients 0.3). The optimized conditions included the application of ultrasound for 42 min, a material:solvent ratio of 1:17, the use of 62% ethanol for solvent, and two extraction cycles to arrive at a weighted value of 119.27, which was close to the predicted value of 120.47. The established extraction process was simple and applicable with desirable reproducibility and predictability.
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裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.为马鞭草科紫珠属植物，药用部位为干燥叶片，分布于海南、广东及广西等地，为海南省道地药材。据调查，2016年海南岛裸花紫珠的总栽培面积约为10.09 hm2，产量约为962 t干品，种植裸花紫珠已经成为海南岛中部地区农民的主要经济来源之一[1-2]。裸花紫珠药材成分复杂，含黄酮类、酚类、皂苷类、鞣质、糖类等多种化合物[3-5]，具有消炎、止血、抑菌、抗氧化等功效，主治化脓性炎症、烧烫伤及外伤出血等[5-7]。目前对于裸花紫珠的研究多集中在有效成分含量测定[8-9]、成分分析[10-11]及药理研究[11-12]等方面，针对裸花紫珠提取工艺优化，也仅见对裸花紫珠总黄酮、总皂苷等单独一类成分的工艺优化，而裸花紫珠一般以浸膏入药，良好的止血消炎等功效是黄酮类、酚酸类及皂苷类等多种成分共同作用的结果，目前并未见到针对这些药效物质混合提取工艺优化相关方面的研究。基于此，本研究以浸膏得率、总黄酮、总皂苷和总酚酸为主要评价指标，采用响应面法优化裸花紫珠叶中浸膏及总有效成分的提取工艺，以期为裸花紫珠药材及其制剂的质量控制和开发应用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试样品为裸花紫珠的成熟叶，于2016年4~6月采自农业部儋州热带药用植物种质资源圃中同一区域的裸花紫珠植物，经庞玉新研究员鉴定为马鞭草科紫珠属裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.。
芦丁(生产批号P29D4F6327)、没食子酸(生产批号Y15D6R6713)、齐墩果酸(生产批号20170423)均购于上海源叶生物制药公司，纯度均大于98%；亚硝酸钠(NaNO2)、硝酸铝(Al(NO3) 3·H2O、氢氧化钠(NaOH)、碳酸钠(NaCO3)、香草醛(C8H8O3)、福林酚、高氯酸、冰醋酸均购于西陇化工股份有限公司，且均为分析纯，水为超纯水。
Sartarius CPA225D电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；KQ-500DB型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；UNICO2012-PCS紫外可见分光光度[尤尼柯(上海)仪器有限公司]；旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)。
1.2 试验方法
1.2.1 裸花紫珠浸膏总黄酮、总酚酸及总皂苷含量测定
(1) 样品处理：称取5 g裸花紫珠样品粉末(过20目筛)，在不同提取工艺下进行提取，将提取液置于65℃下旋转蒸发6 min，转置于15 mL蒸发皿，烘干至恒重，得干浸膏。用少量70%乙醇溶解并转移至50 mL容量瓶中，定容，再移取1 mL至5 mL容量瓶定容，即得裸花紫珠供试液。
(2) 含量测定：参考颜小捷等[13]的方法对裸花紫珠供试液的总黄酮、总酚酸及总皂苷的含量进行测定。
1.2.2 裸花紫珠有效成分提取工艺优化单因素试验
优化提取方法、提取时间、料液比、乙醇体积分数、提取次数等因素对裸花紫珠浸膏及有效成分提取率的影响：提取方法[煎煮法(药典)、回流、水浴、超声水提、超声醇提，除超声醇提的提取溶剂为70%乙醇外，其余均为水]，提取时间(20、30、40、50、60、90、120 min)，料液比(1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)，乙醇体积分数(0%、15%、30%、45%、60%、75%、90%、100%)，提取次数(1~3次)，提取液按“1.2.1”项的方法处理得干浸膏，称量浸膏重量，测定浸膏中总黄酮、总酚酸及总皂苷含量。
1.2.3 裸花紫珠有效成分提取工艺响应面优化
在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选取提取时间(A)、料液比(B)、乙醇体积分数(C)3个因素作为自变量，以各单因素试验最优取值为中心，上下区域各取1个水平值作为响应面试验设计水平，以提取物中浸膏得率与有效成分总含量(总黄酮、总酚酸、总皂苷含量之和)的加权评分值为因变量(Y)(加权评分值=浸膏得率×0.7+有效成分总含量×0.3)，设计3因素3水平17个试验点的响应面分析，其中零点试验重复5次，以估计误差，Box-Behnken设计因素及水平见表 1。
表 1 Box-Behnken设计试验水平及因素Table 1. Levels and factors of Box-Behnken experimental design因素 水平 -1 0 1 提取时间/min 30 40 50 料液比/(g·mL-1) 1:10 1:15 1:20 乙醇体积分数/% 45 60 75 1.3 数据处理
采用EXCEL 2010进行数据处理，SPSS 21.0进行方差分析，Design-Expert 8.0.6进行响应面及回归分析。
2. 结果与分析
2.1 提取方法对裸花紫珠有效成分提取率的影响
1:10的料液比，提取2次。第一次提取2 h，第2次提取1 h，考察提取方法对裸花紫珠有效成分提取率的影响。结果如表 2所示，超声醇提所得的浸膏得率、总黄酮、总皂苷含量及总有效成分均为最高，且与除回流外的其他提取方法均呈显著性差异(P＜0.05)，超声醇提的总酚酸含量与回流提取差异不显著，但二者均显著高于其他提取方法(P＜0.05)。因此，综合各项因素，以超声醇提法较为适宜。
表 2 不同提取方法对裸花紫珠有效成分提取率的影响Table 2. Effects of different extraction methods on the functional ingredients extraction rates of Callicarpa nudiflora提取方法 浸膏得率/% 总黄酮/(mg·g-1) 总酚酸/(mg·g-1) 总皂苷/(mg·g-1) 有效成分总含量/(mg·g-1) 煎煮 14.30e 57.21b 23.56b 24.27bc 105.05cd 回流 19.00b 78.16a 33.73a 23.60bc 135.49b 水浴 17.10c 62.24b 22.71b 28.45ab 113.38c 超声水提 14.90d 49.42c 22.04b 23.27c 94.72d 超声醇提 24.70a 83.14a 33.40a 31.72a 148.25a 注：多重比较采用Duncan′s法，各成分同列中不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。 2.2 提取时间对裸花紫珠有效成分提取率的影响
料液比1:10，乙醇体积分数70%，超声提取1次，考察提取时间对裸花紫珠有效成分提取率的影响。结果如图 1-A所示，提取时间对浸膏得率的影响较小，当提取时间为40 min时，浸膏得率较高。对总黄酮、总酚酸及总皂苷的影响，总体均呈先上升后下降的趋势，总黄酮与总皂苷为40 min时含量最高，总酚酸为50 min时最高，40 min次之，但二者差异较小，因此，综合各项因素，宜选择超声提取40 min。
2.3 料液比对裸花紫珠有效成分提取率的影响
乙醇体积分数70%，超声提取1次，提取40 min，考察料液比对裸花紫珠有效成分提取率的影响。结果如图 1-B所示，随提取溶剂比例的增大，浸膏得率和总黄酮含量先快速上升，料液比为1:15时，含量最高(分别为18.00%，96.48 mg·g-1)，在1:20时稍有下降，后又呈上升趋势。总酚酸及总皂苷的含量随提取溶剂比例的增大，呈先增大后减小的趋势，料液比为1:15时，含量最高。因此，综合考虑提取效果及节约提取试剂等因素，宜选择1:15的料液比。
2.4 乙醇体积分数对裸花紫珠有效成分提取率的影响
料液比1:15，超声提取1次，提取40 min，考察乙醇体积分数对裸花紫珠有效成分提取率的影响。结果如图 1-C所示，乙醇体积分数为60%时，浸膏得率及总酚酸含量最高。总黄酮含量为75%乙醇体积分数时最高，60%乙醇体积分数次之，且二者含量差异较小。乙醇体积分数为90%时，总皂苷含量最高。因此，综合考虑节约试剂及提取效果，宜选择60%乙醇体积分数。
2.5 提取次数对裸花紫珠有效成分提取率的影响
料液比1:15，乙醇体积分数60%，超声提取40 min，考察提取次数对裸花紫珠有效成分提取率的影响。结果如图 1-D所示，总皂苷含量为提取2次时最高，浸膏得率、总黄酮、总酚酸含量均为提取3次时最高，其次为2次，且除总黄酮外，含量差异较小。为考虑节约提取时间、试剂用量及提取效果，宜选择提取2次。
2.6 回归模型的建立与方差分析
响应面分析结果如表 3所示，采用Design-Expert 8.0.6进行回归分析，得到多元二次回归拟合方程：Y =112.76+2.16A+11.29B+ 3.00C+1.19AB-4.84AC-1.38 BC- 4.60A2-14.26B2-5.09C2(R2=0.960 4，P=0.000 4)。表 4方差分析结果表明：回归方程P < 0.05，说明该模型在本试验研究范围内有统计学意义。失拟项P>0.05，说明该模型拟合程度良好，可用作预测裸花紫珠中浸膏得率、总黄酮、总酚酸、总皂苷最佳工艺参数。在该回归模型下，B、AC、A2、B2、C2对浸膏得率及总有效成分影响显著(P < 0.05)，且提取时间和乙醇体积分数的交互作用较强。由F 值大小可以判断，在所选试验范围内，3个因素对有效成分及浸膏含量的影响排序为：B > C > A，即料液比＞乙醇体积分数＞提取时间。
表 3 中心组合试验设计与结果Table 3. Design and results of central combination experiment试验编号 提取时间/min 料液比(1:x) 乙醇体积分数/% 总黄酮/(mg·g-1) 总酚酸/(mg·g-1) 总皂苷/(mg·g-1) 浸膏得率/% 总有效成分/(mg·g-1) 加权评分值 1 30 10 60 108.52 48.27 55.58 24.80 212.37 81.07 2 50 10 60 107.50 45.54 57.91 25.60 210.94 81.20 3 30 20 60 148.46 67.19 66.35 28.00 282.00 104.20 4 50 20 60 154.85 61.04 79.14 29.40 295.04 109.09 5 30 15 45 147.39 43.90 59.77 26.20 251.06 93.66 6 50 15 45 161.86 46.53 93.52 27.00 301.91 109.47 7 30 15 75 168.55 57.81 61.79 28.40 288.15 106.32 8 50 15 75 162.97 53.03 62.21 27.60 278.21 102.78 9 40 10 45 109.25 35.57 59.10 23.60 203.92 77.70 10 40 20 45 161.11 50.87 54.96 28.60 266.94 100.10 11 40 10 75 126.45 51.12 60.42 25.80 237.99 89.46 12 40 20 75 163.46 55.06 66.45 29.80 284.97 106.35 13 40 15 60 156.67 66.50 69.66 29.20 292.83 108.29 14 40 15 60 159.93 64.23 75.39 29.80 299.55 110.73 15 40 15 60 160.08 67.70 76.79 29.40 304.57 111.95 16 40 15 60 160.98 59.42 92.56 30.00 312.95 114.89 17 40 15 60 183.55 68.07 71.01 30.20 322.63 117.93 表 4 响应面二次回归方程方差分析Table 4. Analysis of variance for response quadratic regression equation来源 自由度 均方 离差平方和 F P 模型 9 263.6762 2373.0857 18.8611 0.0004 A-提取时间 1 37.3828 37.3828 2.6740 0.1460 B-料液比 1 1019.6881 1019.6881 72.9396 < 0.0001 C-体积分数 1 71.9308 71.9308 5.1453 0.0576 AB 1 5.6628 5.6628 0.4051 0.5447 AC 1 93.6654 93.6654 6.7000 0.0360 BC 1 7.5887 7.5887 0.5428 0.4852 A2 1 89.2273 89.2273 6.3825 0.0394 B2 1 856.3946 856.3946 61.2590 0.0001 C2 1 109.2284 109.2284 7.8133 0.0267 残差 7 13.9799 97.8592 失拟项 3 13.9458 41.8373 0.9957 0.4804 纯误差 4 14.0055 56.0219 总和 16 2470.9450 2.7 响应面分析及最佳提取工艺
由图 2可知，响应面交互模型图开口均朝下，说明本试验存在最优解。由图 2-A和图 2-C可知，料液比对有效成分影响较大，等高线图形状均较为接近圆形，且P＞0.05，表明料液比和提取时间、料液比和乙醇体积分数的交互作用均较弱。由图 2-B可知，随提取时间及乙醇体积分数的增大，有效成分含量呈先增大后减小的趋势，且等高线图形状接近椭圆形、P＜0.05，表明提取时间和乙醇体积分数的交互作用较强。
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图 2 响应面图与等高线叠加Figure 2. Response surface diagram and contour line superposition diagram根据响应面优化结果可得，裸花紫珠有效成分的最佳提取工艺为：提取时间42.14 min，料液比1:16.99，乙醇体积分数62.08%，预测浸膏得率及有效成分总含量的加权评分值为120.47。为实际操作方便，将最优提取条件调整为：超声提取时间42 min，料液比1:17，乙醇体积分数62%，提取次数2次。在此优化条件下进行验证试验，平行试验3次，取平均值，实际测出的加权评分值为118.27，与预测值相差较小，说明该方法与实际情况拟合良好，验证了采用响应面法优化得到的提取条件准确可靠。
3. 讨论与结论
2015版《中国药典》中记载裸花紫珠干浸膏为裸花紫珠加水煎煮后，浓缩干燥所得[14]。目前市场上的裸花紫珠片、裸花紫珠胶囊等也均以水提后所得裸花紫珠浸膏为原料。研究发现浸膏中有效成分为黄酮类、酚酸类及皂苷类等[5]，因此以浸膏得率及上述3种有效成分作为评价指标对裸花紫珠药材质量控制具有重要意义。本研究通过考察煎煮法、回流、水浴、超声水提、超声醇提等5种不同提取方法，发现裸花紫珠功能叶经超声醇提所得的浸膏得率和有效成分较高，且提取时间短，提取效率较高。
响应面设计已在中药提取行业广泛应用，能够迅速有效地对多个影响因素进行交叉考察，并通过模拟模型得到最优解，相较于正交设计和均匀设计，响应面设计所得回归方程精确度高，且能减少最佳条件下效应的预测值和实测值偏差，具有突出的优越性[15]。本研究以浸膏得率、总黄酮、总酚酸及总皂苷3种有效成分总含量的加权评分值为优化指标，以提取时间、料液比、乙醇体积分数为考察因素，通过Box-Behnken响应面法优化试验，所得回归模型拟合程度高，能够准确模拟裸花紫珠提取实际情况，为裸花紫珠药材及其制剂的质量控制和进一步开发应用提供了参考。
本研究结果表明，裸花紫珠有效成分的最佳提取工艺为：超声提取时间42 min，料液比1:17，乙醇体积分数62%，提取2次。此条件下加权评分值为119.27，与预测加权评分值(120.47)相差较小。优化后的裸花紫珠有效成分提取工艺简单可行，重现性和可预测性较好。
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图 2 响应面图与等高线叠加
Figure 2. Response surface diagram and contour line superposition diagram
表 1 Box-Behnken设计试验水平及因素
Table 1 Levels and factors of Box-Behnken experimental design
因素 水平 -1 0 1 提取时间/min 30 40 50 料液比/(g·mL-1) 1:10 1:15 1:20 乙醇体积分数/% 45 60 75 
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表 2 不同提取方法对裸花紫珠有效成分提取率的影响
Table 2 Effects of different extraction methods on the functional ingredients extraction rates of Callicarpa nudiflora
提取方法 浸膏得率/% 总黄酮/(mg·g-1) 总酚酸/(mg·g-1) 总皂苷/(mg·g-1) 有效成分总含量/(mg·g-1) 煎煮 14.30e 57.21b 23.56b 24.27bc 105.05cd 回流 19.00b 78.16a 33.73a 23.60bc 135.49b 水浴 17.10c 62.24b 22.71b 28.45ab 113.38c 超声水提 14.90d 49.42c 22.04b 23.27c 94.72d 超声醇提 24.70a 83.14a 33.40a 31.72a 148.25a 注：多重比较采用Duncan′s法，各成分同列中不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。
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表 3 中心组合试验设计与结果
Table 3 Design and results of central combination experiment
试验编号 提取时间/min 料液比(1:x) 乙醇体积分数/% 总黄酮/(mg·g-1) 总酚酸/(mg·g-1) 总皂苷/(mg·g-1) 浸膏得率/% 总有效成分/(mg·g-1) 加权评分值 1 30 10 60 108.52 48.27 55.58 24.80 212.37 81.07 2 50 10 60 107.50 45.54 57.91 25.60 210.94 81.20 3 30 20 60 148.46 67.19 66.35 28.00 282.00 104.20 4 50 20 60 154.85 61.04 79.14 29.40 295.04 109.09 5 30 15 45 147.39 43.90 59.77 26.20 251.06 93.66 6 50 15 45 161.86 46.53 93.52 27.00 301.91 109.47 7 30 15 75 168.55 57.81 61.79 28.40 288.15 106.32 8 50 15 75 162.97 53.03 62.21 27.60 278.21 102.78 9 40 10 45 109.25 35.57 59.10 23.60 203.92 77.70 10 40 20 45 161.11 50.87 54.96 28.60 266.94 100.10 11 40 10 75 126.45 51.12 60.42 25.80 237.99 89.46 12 40 20 75 163.46 55.06 66.45 29.80 284.97 106.35 13 40 15 60 156.67 66.50 69.66 29.20 292.83 108.29 14 40 15 60 159.93 64.23 75.39 29.80 299.55 110.73 15 40 15 60 160.08 67.70 76.79 29.40 304.57 111.95 16 40 15 60 160.98 59.42 92.56 30.00 312.95 114.89 17 40 15 60 183.55 68.07 71.01 30.20 322.63 117.93
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表 4 响应面二次回归方程方差分析
Table 4 Analysis of variance for response quadratic regression equation
来源 自由度 均方 离差平方和 F P 模型 9 263.6762 2373.0857 18.8611 0.0004 A-提取时间 1 37.3828 37.3828 2.6740 0.1460 B-料液比 1 1019.6881 1019.6881 72.9396 < 0.0001 C-体积分数 1 71.9308 71.9308 5.1453 0.0576 AB 1 5.6628 5.6628 0.4051 0.5447 AC 1 93.6654 93.6654 6.7000 0.0360 BC 1 7.5887 7.5887 0.5428 0.4852 A2 1 89.2273 89.2273 6.3825 0.0394 B2 1 856.3946 856.3946 61.2590 0.0001 C2 1 109.2284 109.2284 7.8133 0.0267 残差 7 13.9799 97.8592 失拟项 3 13.9458 41.8373 0.9957 0.4804 纯误差 4 14.0055 56.0219 总和 16 2470.9450
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