香瓜又称甜瓜，属葫芦科，一年蔓生草本植物，因瓜果香甜而得名，是夏令消暑上品，可与西瓜相媲美。富含蛋白质、脂质、碳水化合物、粗纤维、维生素(Vc、V_B、胡萝卜素)、矿物质(P、Ca、Fe)有机酸等营养组分和一些呈香组分^[1]，果肉可生食，具有清热、解暑、美容养颜、消除疲劳、止咳利尿、除口臭等保健功效，更有研究认为其中所含的“葫芦素”对癌细胞具有一定的抑制作用^[2]，是一种可用于研制发酵饮料的绝佳原料。

目前香瓜主要是鲜吃，对其进行深加工的研究报道较少。然而，近年来，随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，果醋等相关保健饮品逐渐受到人们的关注^[3]。因此，以香瓜为原料，研发集风味、口感和保健功效于一体的新型保健果醋饮品，必将成为今后研究的热点之一。这不仅提供新的果醋品种和满足消费者多元化的消费需求，更能为提高香瓜产业的附加值和果农的经济收入提供新的渠道。

国内外对水果果醋工艺的研究报道虽已较为成熟，但对香瓜果醋发酵工艺进行系统研究的报道较少。本研究以香瓜为原料，通过单因素、响应面试验设计来优化香瓜果醋发酵工艺，旨在为制备醇、酸合适的香瓜果醋饮品并为香瓜果醋酿造提供一定的理论支撑和技术指导。

1.   材料与方法

1.1   主要仪器和试剂

1.1.1   仪器与设备

FSM-100型分离式磨浆机(上海嘉虹机电有限公司)；WYT手持式糖量计(成都光学厂)；HH-S₂恒温水浴锅(金坛市程辉仪器厂)；SPX-250B-Z生化培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；THZ-82A水浴恒温振荡器(上海领成生物科技有限公司)。

1.1.2   原料与试剂

市售成熟的香瓜(产于湖南省湘西自治州)；市售优级蔗糖，购于吉首市阳光超市；安琪耐高温酿酒高活性干酵母(湖北安琪酵母股份公司生产)；沪酿1.01号醋酸菌(上海酿造一厂生产)；无水乙醇、氢氧化钠等均为AR级。

1.1.3   测定方法

总酸(以醋酸计)：酸碱滴定法(GB/T 5009.41-2003)；酒精度：白酒分析法(GB/T 10345-2007)；糖度：手持式糖量计(GB/T 12295-1990)。

1.2   试验方法

1.2.1   工艺流程

新鲜香瓜→分选、清洗→削皮(去瓜瓤)→打浆→糖度调整→酒精发酵→醋酸发酵→陈酿→过滤→香瓜果醋。

1.2.2   酵母活化

精确称取0.1 g活性干酵母，用2%葡萄糖液于28~34℃活化1~2 h至产生大量气泡^[4]。

1.2.3   醋酸菌扩大培养

将醋酸菌接入醋酸菌活化培养基中，于32℃恒温振荡200 r·min^-1培养24 h^[5]。

1.2.4   操作要点

香瓜汁制备：新鲜香瓜分选，清洗，削皮去籽，打浆，即得香瓜汁。

糖度调整：用蔗糖将香瓜汁糖度调至试验所需，再于90℃水浴锅中灭菌10 min后冷却至室温。

酒精发酵：向经糖度调整和灭菌后香瓜汁中加入0.3%活化酵母液，于32℃下密封发酵至糖度趋于稳定后转入醋酸发酵。

醋酸发酵：向经上步发酵所得香瓜果酒中加入一定量醋酸菌，调节温度及摇床转速等条件，于恒温水浴摇床中震荡发酵至酸度不变(约7 d)^[4]。

陈酿、过滤：完成醋酸发酵的果醋加入2%的食盐，存放于洁净密闭的罐体中，常温陈酿30 d。

1.3   果醋发酵工艺优化试验设计

本研究对醋酸发酵影响较大的四因素即初始酒精度(0、2%、4%、6%、8%)、发酵温度(32、34、36、38、40℃)、醋酸菌接种量(6%、8%、10%、12%、14%)和震荡转速(120、130、140、150、160 r·min^-1)，先进行单因素，3重复试验基础上，再利用Design-Expert 8.5软件进行Box-Bebnken响应面试验来优化香瓜果醋发酵工艺条件, 试验设计见表 1。

表  1  Box-Behnken试验设计因素

Table  1.  Variables and levels in Box-Behnken central composite design

编码值	酒精添加量/%	接种量/%	发酵温度/℃	摇床转速/(r·min-1)
-1	4	8	34	140
0	6	10	36	150
+1	8	12	38	160

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2.   结果与分析

2.1   单因素试验结果

2.1.1   初始酒精度

由图 1可知，当接种量一定时，醋酸含量及其反应速度随起始酒精度增加而提高。但当起始酒精度达到一定值时，反应速度不再增加，继续增加底物浓度，反应速度反而下降。这是因为过高的乙醇浓度对醋酸菌有抑制作用，使产酸量下降，发酵周期延长^[6]。因而选择6%~8%的起始酒精度比较合适。

图  1  初始酒精度对醋酸发酵的影响

注：D₁~D₇为发酵时间1~7 d，图 2~4同。

Figure  1.  Effect of initial alcohol content on fermentation

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图  2  温度对醋酸发酵的影响

Figure  2.  Effect of temperature on fermentation

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图  3  醋酸菌接种量对醋酸发酵的影响

Figure  3.  Effect of inoculation of acetobacter on fermentation

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图  4  震荡转速对醋酸发酵的影响

Figure  4.  Effect of mixer rotational speed on fermentation

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2.1.2   发酵温度

由图 2知，在发酵初期(1~4 d)，随发酵温度由32℃增加到40℃的过程中，发酵液酸度不断增高；发酵后期(5~7 d)，温度对发酵液酸值的影响逐渐变小，特别是在36~40℃范围内差别趋小，且有下降趋势^[7]。综合考虑发酵成本和香瓜果醋酸值、口感风味等因素，宜选择36℃进行后续醋酸发酵试验。

2.1.3   醋酸菌接种量

由图 3知，在发酵前期(1~4 d)，体系酸值随醋酸菌接种量增加而增加，醋酸菌接种量对发酵反应速率影响较大；而在发酵后期(5~7 d)，在低浓度范围内(6%~12%)，加大醋酸菌接种量会使发酵液酸值增加；当醋酸菌接种量超过12%后，酸值趋于平缓或略有下降。这主要是由于随着接种量的增加，发酵体系中底物的减少和产物的增加，使得醋酸菌体细胞所处环境劣化，菌体细胞出现衰亡、和自溶现象^[8-9]。因此，应选择醋酸菌的接种量为10%进行后续试验。

2.1.4   摇床转速

由图 4知，发酵初期(1~3 d)，随摇床震荡转速增加，发酵液酸值增加较为显著；发酵后期(4~7 d)，摇床转速较低时(120~140 r·min^-1)，酸值随当摇床转速增加显著增加，当转速在140~160 r·min^-1范围内，酸值增加不大。这可能是由于转速增加能使发酵液中乙醇挥发、损耗速率上升，从而不能满足醋酸菌生长、繁殖和代谢的需求，使醋酸生成速率下降^[10]。因此，选择摇床震荡的转速为140~150 r·min^-1进行后续试验。

2.2   响应面试验优化

2.2.1   Box-Behnken试验设计及结果

在单因素试验基础上，以接种量(X₁)、初始酒精度(X₂)、发酵温度(X₃)、摇床转速(X₄)为自变量，香瓜汁发酵液醋酸含量为响应值(R)，采用Box-Behnken设计，共29个试验点，其中1~24为分析因子，25~29为中心试验点(主要用于评估试验纯误差^[11])，来优化香瓜果醋醋酸发酵工艺参数。试验设计及结果见表 2。

表  2  Box-Behnken试验设计及试验结果

Table  2.  Arrangement and results of Box-Behnken central composite experiment

试验号	因素				醋酸含量R/%
	X1	X2	X3	X4
1	-1	-1	0	0	3.3
2	-1	1	0	0	4.3
3	1	-1	0	0	3.3
4	1	1	0	0	4.5
5	0	0	-1	-1	4.3
6	0	0	-1	1	5.0
7	0	0	1	-1	4.4
8	0	0	1	1	4.9
9	-1	0	0	-1	4.3
10	-1	0	0	1	4.5
11	1	0	0	-1	4.7
12	1	0	0	1	5.2
13	0	-1	-1	0	3.3
14	0	-1	1	0	3.0
15	0	1	-1	0	3.9
16	0	1	1	0	4.3
17	-1	0	-1	0	4.0
18	-1	0	1	0	4.2
19	1	0	-1	0	5.1
20	1	0	1	0	4.4
21	0	-1	0	-1	3.1
22	0	-1	0	1	3.2
23	0	1	0	-1	3.6
24	0	1	0	1	4.3
25	0	0	0	0	5.3
26	0	0	0	0	5.5
27	0	0	0	0	5.1
28	0	0	0	0	5.2
29	0	0	0	0	5.3

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2.2.2   模型的建立及显著性检验

利用Design-Expert软件对表 2中试验数据进行二次线性回归拟合，得到数学模型：R₁=5.28+0.22X₁+0.47X₂-0.025X₃+0.23X₄+0.05X₁X₂-0.20X₁X₃+0.075X₁X₄+0.17X₂X₃+0.15X₂X₄-0.050X₃X₄-0.29X₁²-1.26X₂²-0.41X₃²-0.34X₄²

由表 3知，模型的P＜0.000 1显著，失拟项的P＞0.05不显著，模型的决定系数R²= 0.958 1，调整决定系数R_Adj²=0.916 2。说明所建模型的拟合程度较高，能在90%以上的范围内解释因变量与变量之间的关联，因此，可用此模型预测和分析香瓜汁的醋酸发酵工艺^[12]。在所考察的因素中，一次项X₁、X₂、X₄及二次项X₂²、X₃²、X₄²差异极显著，X₁²则显著，交互二次项则不显著，说明单独因子对响应值的影响较大，且并非简单的一次线性关系，两因子之间的交互作用对响应值影响相对较小^[13]。各因子对响应值得影响主次顺序为：接种量＞摇床转速＞酒精添加量＞发酵温度。

表  3  回归统计分析结果

Table  3.  ANOVA for response surface regression model

系数来源	平方和	自由度	均方	F值	Prob＞F	显著性
模型	14.89	14	1.06	22.86	＜0.0001	**
X1	0.61	1	0.61	13.06	0.0028	**
X2	2.71	1	2.71	58.20	＜0.0001	**
X3	＜0.0001	1	＜0.0001	0.16	0.6941
X4	0.61	1	0.61	13.06	0.0028	**
X1X2	＜0.0001	1	＜0.0001	0.21	0.6500
X1X3	0.16	1	0.16	3.44	0.0849
X1X4	0.022	1	0.022	0.48	0.4982
X2X3	0.12	1	0.12	2.63	0.1270
X2X4	0.090	1	0.090	1.93	0.1860
X3X4	＜0.0001	1	＜0.0001	0.21	0.6500
X12	0.53	1	0.53	11.39	0.0045	*
X22	10.31	1	10.31	221.64	＜0.0001	**
X32	1.09	1	1.09	23.53	0.0003	**
X42	0.73	1	0.73	15.72	0.0014	**
残差	0.65	14	0.047
失拟	0.56	10	0.056	2.56	0.1891	不显著
净误差	0.088	4	0.022
总离差	15.54	28
相关系数(R2)	0.9581
调整复相关系数(RAdj2)	0.9162
注：“**”表示极显著(P＜0.01)，“*”表示显著(P＜0.05)。

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2.2.3   响应面分析

通过Design Expert 8.5软件对试验数据进行二次多元回归拟合，得响应曲面和等高线图(图 5~8)。各因素及其之间交互作用对响应值的影响可由响应曲面图和等高线图直观的反应出来，如两因子等高线呈椭圆形则表明两者交互作用显著，圆形则反之，等高线交点越密集，说明该因素对响应值的影响越显著^[14-15]。

图  5  R₁=(X₁，X₂)的响应面

Figure  5.  Response surface plot for fermentation under varied alcohol content and acetobacter inoculation

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图  6  R₁=(X₁，X₃)的响应面

Figure  6.  Response surface plot for fermentation under varied temperature and alcohol content

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图  7  R₁=(X₁，X₄)的响应面

Figure  7.  Response surface plot for fermentation under varied alcohol content and mixer rotational speed

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图  8  R₁=(X₃，X₄)的响应面

Figure  8.  Response surface plot for fermentation under varied mixer rotational speed and temperature

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由图 5~8知，当分别固定某一因素值时，发酵液酸值随另外两因素增加，先增加而后降低或趋于平缓，均存在一定极值区域^[16]。因此，通过对所得回归方程求一阶偏导，得出优化极值条件为：X₁= 0.48，X₂= -0.21，X₃=-0.15，X₄= 0.44，此时R₁= 5.45；利用编码公式${{X}_{1}}=\frac{{{x}_{j}}-{{x}_{0}}}{\Delta j}$, 将上述编码值转化为实际参数为酒精添加量6.96%，醋酸菌接种量9.58%，发酵温度35.70℃，摇床转速154.40 r·min^-1[17]。

2.3   验证试验

根据回归方程的最优解和实际情况确定香瓜醋的优化工艺参数为：初始酒精度7%、醋酸菌接种量9.5%、发酵温度36℃、摇床转速155 r·min^-1，在此条件下，香瓜醋的酸值为(5.33±0.15)%，与预测值仅相差0.30%，说明该回归模型对香瓜醋酸发酵的拟合程度较好，具有较强的实用参考价值。

3.   讨论与结论

本研究通过单因素和响应面优化试验得香瓜果醋发酵的最佳工艺分别为：醋酸菌接种量9.5%，发酵温度36℃，初始酒精度7%，摇床转速为155 r·min^-1，发酵液酸量可达5.33%。利用香瓜果汁发酵所得的香瓜果醋香味浓郁，醇厚；富含膳食纤维、维生素以及有机酸等营养、活性组分，能满足消费者对日益多元化保健果醋的需求。此外，还能为香瓜产品的推广及果农增收起到一定促进作用，具有较好的发展推广前景。

目前，对果酒、果醋发酵工艺进行研究的报道多集中于以酒精度和酸值等单一指标为响应值来评价其发酵工艺好坏。相对比较缺乏对果酒、果醋发酵营养基质代谢情况及其与发酵所产生的果酒和果醋等产品的酒精度、酸值以及其他相关评价指标进展综合优化考虑文献报道^[18]。在今后果醋发酵的工艺研究中，可将果酒、果醋的感官鉴评、营养组分、风味等指标融入优化实验设计中综合筛选优化工艺参数和从代谢和风味等食品组学的角度来系统地研究果酒、果醋发酵与最终产物的关联。此外，近年来，有部分学者将菌种的共固定化技术用于果酒、果醋的发酵工艺优化过程中，并使其发酵周期缩短和产品风味浓郁^[19]。因此，尚需进一步结合新型发酵技术来探明果酒、果醋发酵过程中微生物代谢途径和风味形成机制，来提高发酵产品的质量和消费者的可接受程度，而非通过发酵后期的简单调配。