兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法的建立

王锦祥; 桑雷; 孙世坤; 陈冬金; 陈岩峰; 谢喜平

doi:10.19303/j.issn.1008-0384.2018.08.002

兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法的建立

doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2018.08.002

福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 福建福州 350013

基金项目:

国家现代农业产业技术体系建设专项 CARS-43-G-5

福建省农业科学院杰出青年人才基金项目 JC2018-1

福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项 2015R1023-1

详细信息

作者简介:
王锦祥(1983-), 男, 博士, 助理研究员, 主要从事畜禽疫病防控技术研究

通讯作者:
谢喜平(1966-), 男, 研究员, 主要从事草食动物育种、饲养技术研究与示范推广(E-mail:xxp702@163.com)

中图分类号: S852
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出版历程
- 收稿日期: 2018-06-04
- 修回日期: 2018-08-01
- 刊出日期: 2018-08-01

Duplex PCR Assay for Simultaneous Detections of Staphylococcus aureus and Bordetella bronchiseptica in Rabbits

Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agriculture Sciences, Fuzhou, Fujian 350013, China

摘要

摘要: 为建立同时检测兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的双重PCR检测方法，本研究根据金黄色葡萄球菌的nuc基因和支气管败血波氏杆菌的fimN基因的保守序列设计2对特异性引物，通过优化反应条件，成功建立兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法。该方法对兔多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和魏氏梭菌的检测结果为阴性；能够检出5 pg的金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的基因组DNA；与单重PCR检测方法的符合率为100%。说明本试验建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和准确性，为兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的鉴别诊断提供了有效的技术手段。
- 兔 /
- 金黄色葡萄球菌 /
- 支气管败血波氏杆菌 /
- 双重PCR
Abstract: To develop a duplex PCR assay for simultaneous detections of Staphylococcus aureus and Bordetella bronchiseptica in rabbits, two pairs of specific primers were designed based on the conserved regions of nuc and fimN genes of the pathogens. The methodology with optimized reaction conditions was specific and free of cross-reactions with Pasteurella multocida, Escherichia coli and Clostridieum welchii. The detection limit of the method was 5 pg genome DNA on both pathogens. Moreover, the results obtained by using the duplex PCR assay were in perfect agreement with those determined separately by single PCR determinations. Thus, the newly developed highly specific, sensitive and accurate methodology could be a rapid assay applied for simultaneous identification of S. aureus and B. bronchiseptica present in a diseased rabbit.
- rabbit /
- Staphylococcus aureus /
- Bordetella bronchiseptica /
- duplex PCR assay

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图 1 单重PCR扩增

注：M为DL2000 Marker; 1为金黄色葡萄球菌; 2为支气管败血波氏杆菌。

Figure 1. Single PCR amplification

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图 2 双重PCR退火温度的优化

注：M为DL2000 Marker; 1为53℃; 2为53.5℃; 3为54.4℃; 4为55.8℃; 5为57.5℃; 6为58.8℃; 7为59.6℃; 8为60℃。

Figure 2. Optimization on annealing temperature for duplex PCR assay

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图 3 双重PCR引物浓度的优化

注：M为DL2000 Marker; 1为0.2 μmol·L^-1; 2为0.3 μmol·L^-1; 3为0.4 μmol·L^-1; 4为0.5 μmol·L^-1; 5为0.6 μmol·L^-1。

Figure 3. Optimization on primer concentrations for duplex PCR assay

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图 4 双重PCR特异性试验

注：M为DL2000 Marker; 1为金黄色葡萄球菌; 2为支气管败血波氏杆菌; 3为多杀性巴氏杆菌; 4为大肠杆菌; 5为魏氏梭菌; 6为灭菌ddH₂O。

Figure 4. Specificity of duplex PCR assay

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图 5 双重PCR敏感性试验

注：M为DL2000 Marker; 1为50 ng; 2为5 ng; 3为500 pg; 4为50 pg; 5为5 pg; 6为500 fg; 7为50 fg; 8为5 fg。

Figure 5. Sensitivity of duplex PCR assay

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表 1 双重PCR引物

Table 1. Primers used for duplex PCR assay

病原	靶基因	引物序列(5′-3′)	参考序列登录号	产物大小/bp
金黄色葡萄球菌	nuc	F：ttggttgatacacctgaaacaa；R：cgttgtcttcgctccaaata	DQ399678	322
支气管败血波氏杆菌	fimN	F：gtgatcaccggcaacatc；R：tgcctgtggctttcttca	AF231910	478

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表 2 临床样品检测结果

Table 2. Pathogen detection of duplex PCR assay on clinic samples

样品	已知结果/份	双重PCR方法鉴定结果/份	符合率/%
金黄色葡萄球菌	20	20	100
支气管败血波氏杆菌	24	24	100
混合感染	14	14	100
阴性	5	5	100
总计	63	63	100

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