近年来，由于Pb /Zn矿山的大量开采及其冶炼过程对环境的污染，使得大量Pb进入土壤。Pb是重金属污染最严重的元素之一，也是土壤累积率最高的元素^[1-2]。土壤铅污染会使生态系统的正常功能遭到破坏，对人类健康和生态系统造成巨大威胁，治理和修复铅污染土壤迫在眉睫。

植物修复作为一种以太阳能为驱动的低成本、环境友好、效益高且前景广阔的重金属修复技术，受到越来越多的研究者关注^[3]。目前，重金属植物修复主要是利用超积累植物提取污染土壤中的重金属，从而达到净化土壤的目的。而植物修复技术的基础和关键则是重金属耐性植物和超富集植物(hyper-accumulators)的筛选，现今发现的超富集植物多为生物量小的草本植物，且污染地区的本土优势植物是试验的首选^[4]。由于Pb具有较高的负电性，易与土壤中的有机质和铁锰氧化物等形成共价键，不易被植物吸收，因此，目前已见报道的Pb超富集植物并不多，限制了Pb污染土壤的修复规模。研究表明，伴生在金属矿区的禾本科、菊科、豆科、十字花科、廖科、莎草科、茄科和凤尾蕨科等植物的富集转运效果突出^[5]，已发现了东南景天Sedum alfredii Hance、田箐Sesbania drummondii、马尾草Hemidesmus indicus、圆锥南芥Arabis paniculata、车前草Plantago orbignyana等强耐Pb性富集植物^[6-7]。

但目前对于已发现的不同科属间耐性植物进行综合对比、评价的还比较少，且植物资源分布具有区域性和时间性，因此，为植物修复技术筛选更多超富集植物和高生物量强耐性植物具有重要的现实意义。本研究通过梳理前人对重金属富集植物的研究成果^[8-12]，筛选出西南地区常见的12种草本植物，并对其进行种子萌发、室内盆栽铅胁迫试验，研究12种植物在不同浓度胁迫下的耐铅特性和富集转运特征，以期为积累植物铅耐性机理资料，筛选铅富集植物，充实耐铅基因库提供科学数据参考。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

供试材料来源于贵州师范大学宝山校区相宝山上表层土壤及其本土植株(三脉紫菀Aster ageratoides、血皮菜Gynura bicolor)，另购买种子：黑心菊Rudbeckia hirta、硫华菊Cosmos sulphureus、金盏菊Calendula officinalis、三叶鬼针草Bidens pilosa、紫花苜蓿Medicago sativa、三叶草Campsis grandiflora、黑麦草Lolium perenne、早熟禾Poa pratensis、狗牙根Cynodon dactylon、辣椒276 Capsicum annuum cv. 276，隶属于4科12属。

1.2   试验方法

将采集或买购的种子置于4℃冰箱保存。播种前，将种子用10%的双氧水消毒后，用去离子水冲洗，置于培养皿中在(25±1)℃培养箱里催芽。选用萌发整齐的种子栽植在穴盘中，每孔1株，待长出两片真叶后，选取长势均匀的幼苗，移栽进备好的花盆中，每盆5株为1个处理，设5个重复。供试土壤pH值为7.36，有机质31.24 g·kg^-1，全氮213.52 mg·kg^-1，有效磷4.53 mg·kg^-1，速效钾4.27 mg·kg^-1。设置Pb(NO₃)₂质量浓度分别为0、500、1 000、1 500、2 000 mg·kg^-1，与土样充分混匀后，装入15 cm×18 cm(直径×高)的花盆中，保持田间持水量80%，老化2个月后用于盆栽试验，期间用10%的Hoagland营养液培养。3个月后将植物样品按地上部和根部分离，先用自来水冲洗去除黏附于植物样品上的泥土和污物，再用蒸馏水冲洗2~3遍，滤纸吸干表面水分后在105℃下杀青30 min，然后70℃烘干至恒重，烘干后的植物样品地上、地下部分别称重，再用不锈钢粉碎机粉碎，干燥保存。烘干后备用的植物样品过100目(孔径为0.143 mm)尼龙筛，混匀。采用HNO₃/HCLO₄ (5:1，V:V)在高温、高压下(180℃和160 Pa)用密闭的聚四氟乙烯罐消煮至澄清。消煮后的溶液洗至100 mL容量瓶中，用高纯水定容，采用原子吸收分光光度计(ZEEnit700P)测定铅含量。

1.3   数据处理和评价方法

采用SPSS 22.0和Origin 9.0进行数据分析和图表制作，耐铅性综合评价采用隶属函数法和标准差系数赋予权重法^[13-14]，各指标标准化处理方法、权重、综合评价D值计算，其主要步骤如下：

(1) 运用隶属函数对各指标进行标准化处理：

式中：μ(X_ij)表示i种类j指标的隶属值，X_ij表示i种类j指标的平均测定值，X_jmin和X_jmax分别表示j指标的最小值和最大值。

(2) 权重确定

式中：V_ij表示各指标耐铅系数的标准差系数，W_ij表示各指标的权重系数。

(3) 综合评价D值的计算

式中：D表示各指标的综合评价值，并根据综合评价D值大小对各材料的耐铅性强弱进行排序，以判断参试材料耐铅能力的大小。

2.   结果与分析

2.1   不同Pb浓度胁迫对生物量的影响

不同Pb浓度处理对12种植物地上部干重(Dry weight，DW)的影响如图 1所示，随着Pb浓度的增加，12种植物地上部DW总体呈现波动下降的趋势。黑麦草、三叶草、三叶鬼针草在土壤Pb添加量为500 mg·kg^-1时，其地上部DW呈现小幅上升的趋势，表明低浓度的Pb会在一定程度上促进植物的生长。刘素纯等研究表明，Pb浓度低于200 mg·kg^-1会促进黄瓜幼苗的生长，这种现象是因为低浓度的重金属会促进植物根茎分泌出有机酸，刺激植物生长^[15]。而当土壤Pb添加量为2 000 mg·kg^-1时，狗牙根、早熟禾、黑心菊、硫华菊、血皮菜、金盏菊、紫花苜蓿的地上部DW与CK相比显著下降，分别下降了39.01%、64.36%、71.54%、35.47%、36.42%、33.98%和35.03%，三脉紫菀和辣椒276在此质量浓度下无存活率，说明高浓度Pb胁迫下植物表现出明显的抑制作用，植物根系吸收土壤中施入的高浓度Pb后，主要以Pb(PO₄)₂和PbCO₃等形式沉淀以及离子态和络合态存在，当植物Pb吸收达到饱和状态时，由于根细胞的吸附、钝化或沉淀作用，植物根系所吸收的Pb向地上部运输困难，导致毒性累积，抑制植物对K、Ca、Mg等大量元素及微量元素Fe、Cu、Zn等的吸收，使植物因营养元素缺乏而导致生长缓慢或死亡^[16-17]。

图  1  不同Pb处理浓度对12种植物地上部干重的影响

注：图中不同小写字母表示差异达显著水平(P＜0.05)。

Figure  1.  Effect of Pb concentrations in soil on above-ground biomass of 12 species

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2.2   不同Pb浓度胁迫下植物根系和茎叶的Pb含量

由图 2可知，12种植物对总Pb的吸收量表现为根系>茎叶。在土壤Pb添加量为500、1 000、1 500和2 000 mg·kg^-1时，豆科植物(紫花苜蓿、三叶草)和茄科植物(辣椒276)茎叶的Pb吸收量远小于禾本科植物(狗牙根、黑麦草和早熟禾)，且均未超过1 000 mg·kg^-1；而在4种浓度处理下，狗牙根、黑麦草和早熟禾的根系Pb吸收量均超过相应对照组，可以看出禾本科的狗牙根、黑麦草和早熟禾较于豆科的紫花苜蓿、三叶草以及茄科的辣椒276对Pb元素具有更强的根系吸附性；而在菊科植物中，三脉紫菀和黑心菊根系的总Pb吸收量明显强于同科的硫华菊、血皮菜、金盏菊和三叶鬼针草，说明不同科属植物对Pb的耐性机制存在差异，同科植物对不同浓度的Pb胁迫的反应机制也不相同。

图  2  不同浓度处理下植物茎叶及根系的Pb含量

注：横坐标下植物A为狗牙根，B为黑麦草，C为早熟禾，D为三脉紫菀，E为黑心菊，F为硫华菊，G为血皮菜，H为辣椒276，I为三叶草，J为紫花苜蓿，K为金盏菊，L为三叶鬼针草。图中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别为500、1 000、1 500、2 000 mg·kg^-1浓度r Pb胁迫处理。

Figure  2.  Pb in above- and under-ground parts of plants grown on soil with varied Pb additions

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2.3   不同Pb质量浓度胁迫下的植物富集和转运特征

富集系数(Bioconcentration Factor, BCF)指植物地上部与土壤重金属含量的比值，转运系数(Translocation Factor, TF)则是地上部与地下部重金属含量的比值，代表了植物向上转移重金属的能力，不同科属植物在不同质量浓度Pb胁迫下富集转运差异显著^[18]。由图 2可知：在土壤Pb添加量为1 500 mg·kg^-1时，禾本科的狗牙根、黑麦草、早熟禾根系铅吸收量均达到2 000 mg·kg^-1以上，早熟禾最高达4 381 mg·kg^-1；而菊科的三脉紫菀、黑心菊、硫华菊、血皮菜，茄科的辣椒276和豆科的三叶草的平均铅吸收量也高于1 000 mg·kg^-1，说明这6种植物铅的吸收性较好，而紫花苜蓿基本无富集作用。土壤Pb添加量为1 500 mg·kg^-1时12种植物的富集和转运系数如表 1所示：(1)BCF大于1的共有6种，依次为：早熟禾(3.46)>三脉紫菀(3.34)>黑麦草(2.32)>狗牙根(1.78)>黑心菊(1.72)>辣椒276(1.26)；(2)植物TF大于1的共有3种，依次为：辣椒276(1.36)>黑心菊(1.30)>紫花苜蓿(1.23)。综合分析富集系数和转运系数两项指标，辣椒276和黑心菊能很好地从土壤中吸收并从根系向地上部富集转运铅，但辣椒276不能耐受2 000 mg·kg^-1的质量浓度，其耐Pb性阈值稍低。所以，黑心菊是供试植物中理想的铅富集植物，具备了对Pb元素修复的巨大潜力。

表  1  12种植物的富集及转运系数

Table  1.  Pb BCF and TF of 12 species

植物	狗牙根	黑麦草	早熟禾	三脉紫菀	黑心菊	硫华菊	血皮菜	辣椒276	三叶草	紫花苜蓿	三叶鬼针草	金盏菊
BCF	1.78	2.32	5.46	3.34	1.72	0.75	0.75	1.26	0.83	0.11	0.22	0.24
TF	0.15	0.12	0.11	0.27	1.30	0.14	0.48	1.36	0.39	1.23	0.39	0.42

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2.4   耐铅性综合评价

利用隶属函数法和标准差系数赋予权重法对12种植物的耐Pb性进行排序，在前人基础上采用株高、根长、地上和地下生物量，以及地上部、地下部铅吸收量等6个植物基本生长指标，来反映植物的综合耐铅性(表 2)。对数据进行标准化处理之后，根据前述公式(2)、(3)，计算各指标的权重系数依次为0.10、0.08、0.08、0.12、0.30和0.32。最后按照综合评价D值从高到低的顺序进行排名，结果依次为：三叶草>黑麦草>早熟禾>三脉紫菀>三叶鬼针草>硫华菊>狗牙根>紫花苜蓿>血皮菜>辣椒276>黑心菊>金盏菊。

表  2  不同植物的单项耐铅系数、隶属函数值及综合评价D值

Table  2.  Individual Pb tolerance, subordination value and comprehensive evaluation D score of different species

植物	各指标耐Pb系数							隶属函数值						综合评价D值	耐铅性排序
	株高	根长	地上生物量	地下生物量	地上部铅含量	地下部铅含量		μ(1)	μ(2)	μ(3)	μ(4)	μ(5)	μ(6)
狗牙根	0.87	0.70	0.80	0.89	5.71	26.03		0.639	0.450	0.597	0.625	0.323	0.576	0.504	7
黑麦草	0.89	0.72	0.78	0.83	22.28	56.98		0.722	0.533	0.549	0.555	0.559	0.477	0.568	2
早熟禾	0.96	0.70	0.65	0.82	3.15	37.46		0.576	0.440	0.569	0.564	0.501	0.581	0.542	3
紫花苜蓿	0.85	0.70	0.76	0.97	3.26	3.21		0.574	0.560	0.442	0.582	0.411	0.486	0.486	8
三叶草	0.96	0.70	0.79	0.86	2.50	2.63		0.480	0.628	0.574	0.587	0.694	0.457	0.569	1
黑心菊	0.86	0.70	0.39	0.54	8.48	8.99		0.625	0.600	0.322	0.331	0.535	0.355	0.450	11
硫华菊	0.84	0.71	0.74	0.58	2.11	11.11		0.435	0.550	0.436	0.172	0.524	0.697	0.523	6
金盏菊	0.95	0.73	0.67	1.18	1.27	4.39		0.591	0.880	0.264	0.273	0.398	0.338	0.411	12
三叶鬼针草	1.00	0.73	0.95	0.87	1.12	4.53		0.516	0.671	0.527	0.619	0.410	0.573	0.528	5
血皮菜	0.94	0.72	0.77	0.60	1.56	2.16		0.400	0.500	0.502	0.459	0.487	0.476	0.474	9
三脉紫苑	0.84	0.64	0.70	0.75	12.95	12.00		0.533	0.500	0.612	0.610	0.527	0.492	0.531	4
辣椒276	1.26	0.68	0.76	0.74	4.17	4.05		0.698	0.417	0.576	0.521	0.300	0.474	0.454	10
权重								0.10	0.08	0.08	0.12	0.30	0.32

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而石汝杰等^[19]曾通过地上部铅含量、根系铅含量、根系耐性指数以及富集系数4个指标对禾本科三种植物耐铅性进行研究，最终得出其耐铅性依次为:黑麦草>早熟禾>狗牙根，与本研究得出的结论一致，故此综合评价法可信度较高。从综合评价结果来看，三叶草耐铅性评价较高，其在各种质量浓度铅处理下各生长指标表现正常，铅吸收量较低，表现出明显的抗铅性，而黑麦草、早熟禾等禾本科耐性优势则表现为具有良好的铅吸收性，可将其作为铅锌矿区或铅重污染地区首选的耐性培育植物，实际的修复效果需要大田试验的进一步验证。

3.   讨论与结论

铅在土壤中的植物有效性较低，向植株地上部的转运困难，对大多数非超富集植物而言，根系所吸收的铅大部分被滞留于根系组织(大约为90%)，仅有少量铅借助共质体途径向地上部输送并累积^[20]。本研究供试的12种植物中，早熟禾、硫华菊和狗牙根在1 500 mg·kg^-1质量浓度处理下，其滞留率分别为0.89、0.88和0.85，而在耐铅性综合评价中，3种植物的耐铅性分别为第3、第6和第7，这说明植物耐Pb性和重金属根际滞留率成正相关，滞留率越高，耐性越强。Dushenkov和Rai等^[21-22]研究也发现，植物根系所分泌的磷酸盐可与Pb结合形成难溶性的磷酸铅，再经过螯合、络合、沉淀、分解、氧化还原等过程来改变重金属的化合价，降低重金属Pb的可移动性和生物有效性，并阻滞其向地上部运输，从而增强植物的耐Pb性。

超富集植物是指能超量吸收重金属并能将其不断转运到地上部的植物^[23], 一般具有3个特征：①临界含量特征，植物体内重金属临界含量定为：Zn、Mn为10 000 mg·kg^-1，Pb、Cu、Ni、Co、As为1 000 mg·kg^-1，Cd为100 mg·kg^-1；②具有富集系数和转移系数特征，即富集和转运系数均大于1；③具有一定的耐性能力。本研究供试的12种植物中，只有黑心菊能同时具备以上3个条件。以往发现的超富集植物生物量小，生长缓慢，重金属迁移总量相对不高。植物地上部的累积总量是评价植物修复重金属污染土壤潜力的重要指标，修复潜力指数即植株地上部累积总量，为植株地上部重金属含量与地上部生物量之积^[24]。由图 3可知，黑心菊地上部Pb累积总量与Pb处理质量浓度符合二项式拟合曲线y= -0.002x²+ 4.0994x+475.86，且拟合度R²=0.9703，由拟合曲线可知，黑心菊地上部Pb累积总量并非随着Pb处理质量浓度的增加而增加，而是呈现先上升后下降的趋势，在1 000 mg·kg^-1附近时，其累积总量达到一个饱和的状态，并且在达到临界值之后，其累积总量开始下降。根据拟合方程，在土壤Pb质量浓度为1 025 mg·kg^-1时，黑心菊地上部铅积累量最高，为2.576 mg·株^-1，显著高于对照。而王红旗等^[25]研究的羽叶鬼针草在相同的质量浓度，其地上部铅累积总量为0.326 mg·株^-1，本研究所得的结果是其的7.8倍，说明黑心菊的耐性和吸收能力比羽叶鬼针草更好。可见，当土壤Pb质量浓度在1 000 mg·kg^-1左右时，黑心菊具有最佳的修复潜力。

图  3  黑心菊地上部Pb累积总量随浓度变化的关系曲线

Figure  3.  Pb accumulated in above-ground parts of R. hirta plant as function of Pb concentration applied for treatment

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综上所述，供试植物中狗牙根、黑麦草、早熟禾、三脉紫菀、黑心菊、辣椒276具有较强的富集能力，能有效吸收土壤中的重金属铅；辣椒276、黑心菊和紫花苜蓿有较强的转运能力。通过耐铅性综合评价，三叶草、黑麦草、早熟禾可作为铅锌矿区或铅重污染区耐性栽培植物。黑心菊的富集系数和转运系数均大于1，根据修复潜力指数，其在土壤Pb质量浓度为1 025 mg·kg^-1时，地上部铅积累总量为2.576 mg·株^-1，具有最佳的修复潜力，可作为强富集植物修复铅污染土壤。今后，应加强超富集植物对重金属污染物的富集及解毒机理研究，对于已经筛选出的重金属强耐受性植物种，可以进一步研究植物重金属强耐受性关键基因以及关键基因的克隆，从而构建植物转基因体系，使超富集植物在重金属土壤污染的修复中发挥更大的应用潜力。