Optimization of Chlorella Farming for Shrimp Aquaculture in Aboveground Ponds
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摘要: 介绍一种新型的高位池对虾养殖中独立培育小球藻优化模式工艺，通过单因素和正交试验设计相结合的方法研究温度、光照强度、pH、N/P（氮磷比）、Fe3+浓度等条件对小球藻定向培育的影响，并在高位池对虾养殖中进行实践应用。结果显示最佳育藻条件为温度25℃，光照7 000 lx，pH 8.5，N/P为10：1，Fe3+质量浓度500 μg·L-1，在第9~11 d小球藻有最大比生长率，可将藻液投入养殖池使用。高位池对虾养殖场的实践表明，该方法不但可以节约饲料成本，还可以较好稳定养殖水体的水质。Abstract: Chlorella farming for shrimp aquaculture in aboveground ponds was optimized by using an experiment with single factor and orthogonal design. Factors for the evaluation included light intensity and the temperature, pH, N/P ratio, and Fe3+ concentration in the water for the algae cultivation.A maximized chlorella growth coefficient was reached in 9 to 11 ds by exposing the algae to 7 000 lx light in a pH 8.5 water medium that contained 10:1 N/P nutrients and Fe3+ 500 μg·L-1 at 25℃. Thus, at that time chlorella could be harvested for feeding the shrimps. The practice could not only reduce the cost on feed for the aquaculture, but also stabilize the water quality in the shrimp pond.
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近年来，我国东南沿海地区南美白对虾高位池养殖病害频发，成为制约对虾养殖业持续稳定发展的主要因素[1-2]，早期高位池粗放式的养殖以低廉的成本获取的高效益回报，促使高位池对虾养殖业迅猛发展，同时也加速了近海养殖水体生态环境急剧恶化，成为养殖区病毒性虾病大面积频繁暴发的根本原因。
近年来，众多养殖户采取对海水进行充分消毒后再育藻的预处理方式进行养殖水体优化，但是在养殖中后期换水量激增，从取水消毒到注入换水之间仅有一天时间，无法完成杀菌消毒和肥水育藻的预处理过程[3]。因此，在蓄水消毒池旁建造小型育藻设施，培养高密度的藻液，并将其随蓄水池的水定时加入高位养殖池是解决这一矛盾较为可行的方法。从高位池对虾养殖的实际需要出发，对藻类培育的条件优化具有重要的研究意义和应用价值[4-5]。
本文选取温度、光照、pH、N/P(氮磷比)、Fe3+浓度等因素为研究对象，考察其对养殖池内藻密度和活性的影响，在单因素试验基础上，运用正交试验设计优化培养工艺，以期为高位池对虾养殖育藻工艺提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料及仪器
藻种取自福建诏安县梅岭镇盛臻海产养殖场养殖池，主要为小球藻，采用BG11培养基[6]，初始藻密度在2 000 mL锥形瓶中调节至1.3×106 ind·mL-1左右，光照培养箱进行培养。
试验仪器：上海博讯SW-CJ-2FD洁净工作台；广东科力PYX-800G-B智能光照培养箱；上海安亭科学TDL-40C离心机；日本岛津UV2450紫外分光光度计；德国赛多利斯PB-10 pH计；德国奥多利斯BS124S电子分析天平等。
1.2 试验方法
1.2.1 育藻条件优化
本研究主要选取南美白对虾高位池养殖系统中可控的培育条件，包括温度、光照强度、pH、氮磷比以及Fe3+浓度等[4, 7]。每个培养条件设定5个梯度，其中，结合福建地区气温的变化范围选择15、20、25、30、35℃。光照强度：3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 lx。pH值6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。以2 mg·L-1氨氮含量为基准，通过改变磷浓度来设置初始氮磷比，分别为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1。Fe3+质量浓度：300、400、500、600、700 μg·L-1。培养周期为15 d，每隔1 d测定1次生长情况。首先通过单因素试验考察不同条件的影响效果，并确定相应的比生长率，在单因素试验的基础上进行L25(56)正交试验对育藻条件进行最后优化，具体因素水平见表 1。
表 1 正交试验因素和水平Table 1. Factors and levels of orthogonal experiment水平 温度/℃ 光照/lx pH N/P 铁离子/(μg·L-1) 1 15 3000 6.5 10:1 300 2 20 4000 7.0 20:1 400 3 25 5000 7.5 30:1 500 4 30 6000 8.0 40:1 600 5 35 7000 8.5 50:1 700 养殖场取水水源地为诏安湾，其表层海水盐度春季范围为29.0‰~34.5‰，均值31.83‰，夏季表层盐度变化范围在29.58‰~32.60‰，均值31.73‰[8]。海水盐度均处于小球藻生长的正常盐度范围，因此优化条件略去盐度的影响[9-10]。育藻设施为长×宽×高=1.3 m×1.3 m×1.1 m的方形塑料容器，试验环境为全封闭钢架大棚。
1.2.2 高位池对虾养殖中的应用
中试试验在长宽均为10 m、水深为1.5 m的小型水泥高位池中完成，养殖池投苗量约6万尾，投苗后第31 d起，每日换水1次，换水深度0.15 m，此时将最佳育藻条件下培养至第9 d的藻液与仅经消毒预处理的海水同时注入养殖池，换水时间(8:00，11:00，20:00)监测养殖池pH变化，连续监测20 d以上。
1.3 藻细胞密度及比生长率的测定[11-12]
藻细胞数与光密度呈正相关关系，测定藻液在波长680 nm处的吸光度值，用血球计数板计数藻细胞，可得藻细胞数与藻液吸光度之间的标准曲线方程为：Y=8.081×106X-1.076×105，其中Y表示藻细胞密度(ind·mL-1)；X表示680 nm吸光度A值。
比生长率测定按下式进行计算：R=(lnNt-lnN0)/t，其中：R表示藻生长率/%，Nt表示第t天的藻细胞数，N0表示试验开始时藻细胞数，t表示试验进行时间(单位:d)。
2. 结果与分析
2.1 不同培育条件对藻生长的影响
2.1.1 不同温度对藻生长的影响
从图 1可以看出，在温度10~35℃范围内小球藻均可生长，但在20℃及以下温度时，藻的生长速度比较缓慢，温度25~30℃时，藻的生长速度最快。35℃时，藻的生长出现衰退。
2.1.2 不同光照强度对藻生长的影响
从图 2可知，光照强度高于4 000 lx时，藻的生长速度较快，其中，当光照强度为6 000 lx时，藻密度最高。
2.1.3 不同pH对藻生长的影响
不同的pH值影响细胞内部的酶促反应，从而影响藻对外界环境中营养物质的吸收。从图 3可知，在pH 6.5的弱酸性情况下，藻密度在3~5 d以后明显低于pH高于6.5的培育条件，说明弱酸性环境不利于绿藻生长。pH 8.5时藻密度最高。
2.1.4 不同氮磷比对藻生长的影响
从图 4可知，培养的前7 d，不同氮磷比下的藻生长情况差别不大。随后藻密度迅速增加，在第9~13 d维持在一个较高的水平，13 d以后不同氮磷比下的藻密度有所下降，其中氮磷比为20:1的条件下藻生长情况相对较好。
2.1.5 不同Fe3+质量浓度对藻生长的影响
铁是构成藻细胞内各种生化反应不可或缺的微量营养元素。从图 5可知，Fe3+质量浓度在500 μg·L-1时绿藻的生长效果最好，超过500 μg·L-1时，藻的生长效果反而变差。
2.2 不同育藻条件下的藻最大比生长率
向养殖池内添加藻液的时间根据观察藻培养过程中的比生长率来确定，不同因素条件下最大比生长率及出现时间如表 2所示。
表 2 不同影响因素下藻最大比生长率及出现时间Table 2. Maximum specific growth rate of chlorella and occurrence time under varied conditions项目 处理 最大比生长率/% 出现时间/d 温度 15℃ 5.4 9~11 20℃ 6.8 9~11 25℃ 10.5 9~11 30℃ 11.2 9~11 35℃ 7.3 9~11 光照强度 3000 lx 5.6 9~11 4000 lx 7.4 9~11 5000 lx 10.0 9~11 6000 lx 12.6 9~11 7000 lx 12.1 9~11 pH 6.5 5.6 13~15 7.0 8.8 13~15 7.5 8.5 13~15 8.0 9.5 13~15 8.5 10.8 13~15 N/P 10:01 9.3 9~11 20:01 13.0 9~11 30:01 11.2 9~11 40:01 7.5 9~11 50:01 5.1 9~11 铁离子质量浓度 300 μg·L-1 5.3 9~11 400 μg·L-1 8.5 11~13 500 μg·L-1 9.1 13~15 600 μg·L-1 8.2 11~13 700 μg·L-1 5.2 13~15 从表 2中可以看出尽管单因素试验中不同影响因素的最大比生长率有一定差别，但是大多出现在近似时间段，大约是在第9~11 d。因此在正交试验中选用第10 d的藻密度作为评价标准。
2.3 正交试验分析
在单因素试验及比生长率测定的基础上，以温度、光照强度、pH、N/P、Fe3+质量浓度作为考察因素，进行L25(56)正交试验设计，以培养至第10 d的藻密度作为评价指标(表 3)。
表 3 正交试验结果Table 3. Results of orthogonal experiment因素 温度 光照 pH N/P 铁离子质量浓度 空列 藻密度 处理1 1 1 1 1 1 1 3.04 处理2 1 2 2 2 2 2 3.15 处理3 1 3 3 3 3 3 3.35 处理4 1 4 4 4 4 4 3.56 处理5 1 5 5 5 5 5 3.45 处理6 2 1 2 3 4 5 3.35 处理7 2 2 3 4 5 1 3.21 处理8 2 3 4 5 1 2 3.93 处理9 2 4 5 1 2 3 4.25 处理10 2 5 1 2 3 4 4.30 处理11 3 1 3 5 2 4 5.30 处理12 3 2 4 1 3 5 5.58 处理13 3 3 5 2 4 1 5.47 处理14 3 4 1 3 5 2 5.35 处理15 3 5 2 4 1 3 5.72 处理16 4 1 4 2 5 3 4.89 处理17 4 2 5 3 1 4 5.02 处理18 4 3 1 4 2 5 4.65 处理19 4 4 2 5 3 1 5.41 处理20 4 5 3 1 4 3 5.30 处理21 5 1 5 4 3 2 4.32 处理22 5 2 1 5 4 3 4.20 处理23 5 3 2 1 5 4 4.42 处理24 5 4 3 2 1 5 4.75 处理25 5 5 4 3 2 1 4.55 K1 3.310 4.194 4.330 4.530 4.490 4.348 K2 3.818 4.256 4.414 4.516 4.392 4.190 K3 5.494 4.364 4.412 4.324 4.604 4.642 K4 5.072 4.670 4.502 4.298 4.406 4.536 K5 4.468 4.678 4.504 4.494 4.270 4.356 极差 2.184 0.484 0.174 0.232 0.334 0.452 由表 3极差分析可知，温度对藻的生长影响最大，其次是光照，Fe3+质量浓度、N/P和pH在设定的范围变化对藻的生长影响无显著影响，最佳工艺组合为A3B5C5D1E3，即温度25℃，光照7 000 lx，pH 8.5，N/P为10:1，铁离子质量浓度为500 μg·L-1。
2.4 育藻工艺在高位池对虾养殖中的应用效果
优化后的育藻工艺被应用于南美白对虾高位池养殖，结合养殖池23 d早晚水质监测结果(图 6)可以看出，采用该优化工艺的独立育藻设施进行南美白对虾水质调控可以有效将水体pH稳定在7.5~8.5的安全范围。
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图 6 南美白对虾养殖池水体pH变化过程Figure 6. Changes on water pH in a Penaeus vannamei aquaculture pond3. 讨论与结论
育藻培水是南美白对虾养殖过程中的一项重要工作，它不但有助于改善养殖水体环境，还可以减少南美白对虾的饲料成本。育藻过程中所需调节的环境因素包括水温、光照、营养盐、pH、微量元素等，常用的藻种为小球藻。
养殖水体温度变化将直接影响藻类生理活动的活性及对水体中营养物的利用率。同温度下混合培养的藻类间存在竞争性相互抑制作用。有研究表明小球藻的适宜生长温度为25.0~42.5℃[13-14]。大多数藻类在25℃条件下都能正常生长[15]。
藻类的最大比增长率则与光照强度直接相关。不同种属的藻类其最适宜光强也存在差别[16]。光照能够增加藻类叶绿素合成量，促进藻类大量生长繁殖，但超过一定范围，光照水平提高会抑制细胞叶绿素的合成，从而表现出光抑制作用[17]。徐慧等[18]研究了不同光照强度对小球藻生长的影响效果，结果表明，5 500 lx强度下小球藻生长最好。
只有在适宜的水体pH酸碱度范围内，藻细胞才能正常生长繁殖[19]。薛凌展等[20]考察了在不同pH条件下铜绿微囊藻和小球藻培养效果，结果表明铜绿微囊藻最佳生长pH值为9.0，而小球藻的最佳生长pH值则为8.0。欧阳峥嵘等[14]也证实了小球藻适宜生长条件为pH 6.5~9.0。
氮磷元素对藻类生长的影响存在交互作用，N/P(氮磷比)的变化对细胞的生长速度及其内部物质的合成积累都有重要影响[21-24]。郑晓宇等[25]的研究表明：藻细胞对于氮元素的需求量明显高于磷元素，其最适生长的氮元素质量浓度为16.0~32.0 mg·L-1，而磷元素质量浓度则为2.0~5.40 mg·L-1。董娟等[26]则系统研究了不同氮磷浓度及比例对藻-菌群落结构的影响及其相互关系，结果表明氮限制(N/P=3)和磷限制(N/P=48)均会抑制藻类生长，N/P=12为藻类生长的最适条件。铁是藻类生长所需的重要微量元素之一，藻生长所需铁离子的质量浓度存在阈值，超过这个值后，过量的铁离子会影响藻的物质能量交换，进而阻碍藻的生长繁殖[27-28]。
综合前人的研究，本文选取单因素试验与正交试验设计相结合的方式，考察了温度、光照强度、pH、N/P(氮磷比)、铁离子质量浓度5种因素对于南美白对虾所需藻类培育的影响。结果表明，最佳培育条件为温度25℃，光照7 000 lx，pH 8.5，N/P为10:1，铁离子质量浓度为500 μg·L-1，在育藻过程中应更关注温度和光照变化的影响。该条件下，藻液在培养第9~11 d处于快速增长时期，可汇入对虾养殖池。采用该优化工艺进行独立育藻，可以有效地将养殖池内水体pH稳定在安全范围，有利于营造良好的养殖水体环境。
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图 6 南美白对虾养殖池水体pH变化过程
Figure 6. Changes on water pH in a Penaeus vannamei aquaculture pond
表 1 正交试验因素和水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
水平 温度/℃ 光照/lx pH N/P 铁离子/(μg·L-1) 1 15 3000 6.5 10:1 300 2 20 4000 7.0 20:1 400 3 25 5000 7.5 30:1 500 4 30 6000 8.0 40:1 600 5 35 7000 8.5 50:1 700 
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表 2 不同影响因素下藻最大比生长率及出现时间
Table 2 Maximum specific growth rate of chlorella and occurrence time under varied conditions
项目 处理 最大比生长率/% 出现时间/d 温度 15℃ 5.4 9~11 20℃ 6.8 9~11 25℃ 10.5 9~11 30℃ 11.2 9~11 35℃ 7.3 9~11 光照强度 3000 lx 5.6 9~11 4000 lx 7.4 9~11 5000 lx 10.0 9~11 6000 lx 12.6 9~11 7000 lx 12.1 9~11 pH 6.5 5.6 13~15 7.0 8.8 13~15 7.5 8.5 13~15 8.0 9.5 13~15 8.5 10.8 13~15 N/P 10:01 9.3 9~11 20:01 13.0 9~11 30:01 11.2 9~11 40:01 7.5 9~11 50:01 5.1 9~11 铁离子质量浓度 300 μg·L-1 5.3 9~11 400 μg·L-1 8.5 11~13 500 μg·L-1 9.1 13~15 600 μg·L-1 8.2 11~13 700 μg·L-1 5.2 13~15
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表 3 正交试验结果
Table 3 Results of orthogonal experiment
因素 温度 光照 pH N/P 铁离子质量浓度 空列 藻密度 处理1 1 1 1 1 1 1 3.04 处理2 1 2 2 2 2 2 3.15 处理3 1 3 3 3 3 3 3.35 处理4 1 4 4 4 4 4 3.56 处理5 1 5 5 5 5 5 3.45 处理6 2 1 2 3 4 5 3.35 处理7 2 2 3 4 5 1 3.21 处理8 2 3 4 5 1 2 3.93 处理9 2 4 5 1 2 3 4.25 处理10 2 5 1 2 3 4 4.30 处理11 3 1 3 5 2 4 5.30 处理12 3 2 4 1 3 5 5.58 处理13 3 3 5 2 4 1 5.47 处理14 3 4 1 3 5 2 5.35 处理15 3 5 2 4 1 3 5.72 处理16 4 1 4 2 5 3 4.89 处理17 4 2 5 3 1 4 5.02 处理18 4 3 1 4 2 5 4.65 处理19 4 4 2 5 3 1 5.41 处理20 4 5 3 1 4 3 5.30 处理21 5 1 5 4 3 2 4.32 处理22 5 2 1 5 4 3 4.20 处理23 5 3 2 1 5 4 4.42 处理24 5 4 3 2 1 5 4.75 处理25 5 5 4 3 2 1 4.55 K1 3.310 4.194 4.330 4.530 4.490 4.348 K2 3.818 4.256 4.414 4.516 4.392 4.190 K3 5.494 4.364 4.412 4.324 4.604 4.642 K4 5.072 4.670 4.502 4.298 4.406 4.536 K5 4.468 4.678 4.504 4.494 4.270 4.356 极差 2.184 0.484 0.174 0.232 0.334 0.452
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百度学术
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