羊传染性脓疱也叫羊口疮，是由羊传染性脓疱病毒(也称羊口疮病毒，orf virus，ORFV)引起的绵羊和山羊的嗜上皮性、接触性传染病。该病的发病率为30%～90%，死亡率为1%～59%^[1]。羊传染性脓疱病毒属于痘病毒科副痘病毒属成员，基因组全长约145 kb。世界各养羊国家和地区均有该病流行的报道，我国新疆、内蒙、甘肃、吉林、山西、青海、宁夏、四川、黑龙江、福建等多个省份均有该病发生和流行的报道。该病容易引起继发感染，并且当前的疫苗免疫效果不理想，导致该病的防控异常困难，给世界养羊业造成严重的经济损失。

关于羊传染性脓疱病毒的诊断目前还没有通用标准。该病易与口蹄疫、羊痘等相混淆，需要根据临床症状和实验室检测结果进行确诊。当前，国内外主要的分子生物学诊断方法有PCR、LAMP、SYBR Green I和TaqMan荧光定量PCR等^[2-5]核酸快速检测技术，已建立的荧光定量PCR方法主要针对B2L、F1L及DNA聚合酶基因设计合成引物。尚未见有关于VIR基因荧光定量PCR方法的报道。VIR基因是羊传染性脓疱病毒的主要保守基因之一，该基因可抑制干扰素的抗病毒活性^[6-7]，不同分离株VIR基因编码的氨基酸相似性为92%～94%，且VIR基因所编码的蛋白可产生高效价的抗体^[8-9]。本文建立了一种基于VIR基因检测羊传染性脓疱病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法，可用于该病的病原学检测和流行病学调查。

1.   材料与方法

1.1   病毒株、菌株及临床样品

羊传染性脓疱病毒、溶血性曼氏杆菌、莱氏无胆甾原体、绵羊肺炎支原体、牛支原体及丝状支原体山羊亚种均为本研究室分离、鉴定和保存。大肠杆菌ATCC25922株、多杀性巴氏杆菌CVCC44801株、金黄色葡萄球菌261111株由福建省农业科学院畜牧兽医研究所程龙飞馈赠；39份病羊口鼻部痂皮样品于2014年9月至2017年6月采自福建省福州市、福清市、莆田市、三明市、宁德市、南平市疑似发生羊传染性脓疱羊场。

1.2   主要仪器和试剂

Mastercycler ep realplex RF-PCR仪，购自eppendorf (德国)公司；质粒小量抽提试剂盒，购自Omega Bio-Tek(美国)公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)和pMD19-T载体，均购自宝生物工程(大连)有限公司；荧光PCR管，购自Axygen(美国)公司。

1.3   引物和探针的设计合成

利用Beacon Designer7.9软件针对羊传染性脓疱病毒VIR序列(KF666563.1)设计特异性的荧光引物。上游引物F：5′- CGA TAT CCG GAA AGG TCG TTG-3′；下游引物R：5′- GCT GTT GAT GAG GAT GGT GAG -3′，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.4   标准品的制备

以提取的羊传染性脓疱病毒总DNA为模板，利用设计好的引物通过PCR进行扩增。常规PCR反应体系、反应条件及重组质粒制备参照文献[10]的方法进行，经鉴定正确的重组质粒作为标准品，保存于-70℃。利用NanoDrop 2000测定提取重组质粒的浓度，最终换算为拷贝数浓度。

1.5   荧光定量PCR的建立

1.5.1   荧光定量PCR最佳反应条件的优化

按照SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)试剂盒说明书进行，反应体系参照文献[10]的方法，分别将引物和探针浓度稀释到5、10、15、20 pmol·μL^-1；反应条件为：95℃ 30 s预变性；95℃ 5 s，51℃ 30 s，共40个循环；熔解曲线参数为：95℃ 5 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s，1个循环，退火延伸时检测荧光信号。以产生的荧光值(△Rn)最高、Ct值最小、在熔解曲线中无非特异性峰值为选择依据，并优化退火温度(51～62℃)。应用矩阵法进行优化，筛选最佳浓度的组合。

1.5.2   标准曲线的建立

用EASY Dilution将标准品梯度稀释至10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³ 、10² copies·μL^-1 6个浓度梯度作为阳性模板，按照试剂盒说明书进行操作，具体见参考文献[10]。待反应结束后，由realplex电脑分析软件自动成标准曲线。

1.5.3   荧光定量PCR特异性分析

以重组质粒为阳性对照，以双蒸水作空白对照，在相同条件下对绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性曼氏杆菌、牛支原体、莱氏无胆甾原体的核酸进行荧光定量PCR检测，以验证该方法的特异性。

1.5.4   荧光定量PCR敏感性分析

将稀释成不同浓度的标准品作为模板，同时进行SYBR Green I实时荧光定量PCR和常规PCR扩增^[11]，比较两种方法的敏感性。

1.5.5   荧光定量PCR重复性分析

选取稀释成1×10⁷、1×10⁵、1×10³ copies·μL^-1浓度梯度的标准品，每个浓度梯度重复3次进行检测，根据Ct值算出组内变异系数；上述3个浓度的标准品均设3个重复，每间隔3 d检测1次，连续检测3次，根据Ct值算出组间变异系数，检验该方法的重复性。

1.6   临床样品检测

利用建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法对从福建省发病羊场收集的39份疑似羊传染性脓疱病的病料进行检测，同时和颜新敏等^[11]建立的常规PCR方法进行比较。

2.   结果与分析

2.1   标准品的制备

提取羊传染性脓疱病毒阳性克隆菌液的质粒，做菌液PCR鉴定；电泳和测序结果显示，目的片段大小与预期一致，为96 bp(图 1)，说明羊传染性脓疱病毒的目的片段成功克隆。在荧光定量PCR仪上扩增效果良好(图 2)。

图  1  目的片段的PCR扩增

注：M为DNA标准DL 1 000；1为羊传染性脓疱病毒DNA；2为阴性对照。

Figure  1.  PCR results of target DNA fragment

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图  2  阳性质粒荧光PCR扩增

Figure  2.  The fluorescence quantitative PCR amplification of positive plasmid

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2.2   荧光定量PCR方法的建立

2.2.1   荧光定量PCR最佳优化条件

经矩阵法优化后，最佳引物浓度为上、下游引物(10 μmol·L^-1)各0.5 μL。最佳反应程序：95 ℃ 30 s，95℃ 5 s，55℃ 10 s，72℃ 20 s，共40个循环。

2.2.2   实时荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线

以EASY Dilution梯度稀释(10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10² copies·μL^-1)的6个浓度的标准品作为模板，在Mastercycler ep realplex上进行qPCR扩增，生成标准曲线(图 3)，直线方程为y =-3.061 log (x) +36.73，相关系数R²=0.998，扩增效率E=112%。由熔解曲线结果可见，当Tm=(93±0.23)℃时出现单特异性峰，没有引物二聚体和非特异性扩增产物(图 4)。

图  3  荧光定量PCR标准曲线

Figure  3.  Standard curve of the fluorescence quantitative PCR

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图  4  荧光定量PCR熔解曲线

Figure  4.  Melting curve of the fluorescence quantitative PCR

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2.2.3   荧光定量PCR方法的特异性测定

利用建立的荧光定量PCR方法对羊传染性脓疱病毒、绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性曼氏杆菌、牛支原体、莱氏无胆甾原体和双蒸水进行检测。结果显示，除羊传染性脓疱病毒能扩增出S型曲线外，其他样品均未有扩增(图 5)。

图  5  荧光定量PCR特异性试验

注:1为羊传染性脓疱病毒；2为绵羊肺炎支原体；3为丝状支原体山羊亚种；4为大肠杆菌；5为多杀性巴氏杆菌；6为金黄色葡萄球菌；7为溶血性曼氏杆菌；8为牛支原体；9为莱氏无胆甾原体；10为双蒸水。

Figure  5.  Specificity test for fluorescence quantitative PCR

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2.2.4   荧光定量PCR方法的敏感性测定

将标准品稀释成1×10⁰ ～1×10⁷ copies·μL^-1，同时用常规PCR和荧光定量PCR方法进行检测，以比较该荧光定量PCR的敏感性。结果显示，常规PCR的检测低限为1×10⁴ copies·μL^-1，荧光定量PCR的检测低限100 copies·μL^-1。

2.2.5   荧光定量PCR方法的重复性和稳定性评估

选取稀释成1×10⁷、1×10⁵ 、1×10³ copies·μL^-1浓度梯度的标准品进行组内和组间重复试验，结果显示，组内变异系数为1.08%～1.78%，组间变异系数为1.15%～1.18%(表 1)。

表  1  羊传染性脓疱病毒实时荧光定量PCR的重复性实验结果

Table  1.  Repeatability test results of the real time fluorescence quantitative PCR for ORFV

重组质粒ORFV浓度/(copies·μL-1)	组内重复Ct平均值±标准差	变异系数/%	组间重复Ct平均值±标准差	变异系数/%
1×107	15.19±0.27	1.78	15.23±0.18	1.18
1×105	22.22±0.24	1.08	22.19.±0.26	1.17
1×103	27.95±0.33	1.18	27.93±0.32	1.15

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2.3   临床样品检测

取39份临床样品分别用本文建立的实时荧光定量PCR和常规PCR进行检测，结果显示(表 2)，实时荧光定量PCR和常规PCR检测阳性率分别为94.9%(37/39)和89.7%(35/39)。

表  2  荧光定量PCR和常规PCR检测临床样品结果比较

Table  2.  Comparison of detecting results of clinical samples by using fluorescence quantitative PCR and conventional PCR

检测方法	样品数	阳性样品数	阴性样品数	阳性率/%
荧光定量PCR	39	37	2	94.9
常规PCR	39	35	4	89.7

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3.   讨论

羊传染性脓疱由羊传染性脓疱病毒引起，近10年来在福建省的发病率为10.0%～72.3%，死亡率为10.5%～20.0%^[12]，已成为制约羊场健康发展的重要疫病之一，为加强羊传染性脓疱的流行病学监测和科学有效防控，本研究于国内首次针对VIR基因建立羊传染性脓疱病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。

VIR基因位于羊传染性脓疱病毒基因组的末端，是羊传染性脓疱病毒的一个保守基因，常被用于比较不同毒株之间的亲缘关系，构建系统进化树^[13-14]；VIR基因也是羊传染性脓疱病毒感染后的早期表达基因，它编码VIR蛋白，VIR蛋白能结合dsRNA、抑制蛋白激酶R(PKR)的活性，从而抑制干扰素的抗病毒活性^[6-7]，另一方面，其编码的蛋白可产生高效价的抗体^[8-9]。因此，本研究选择以VIR基因作为检测羊传染性脓疱病毒的目的基因，在此基础上利用生物学软件设计出特异性荧光引物。

SYBR Green I实时荧光定量PCR与传统PCR相比，不仅灵敏度高，而且特异性更好，无需凝胶电泳分析，为临床样品批量检测节省时间，提高检测效率，确保检测结果的准确性。本研究建立的羊传染性脓疱病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法没有非特异性扩增产物和引物二聚体；标准曲线相关系数R²为0.998，扩增效率为112%，具有良好的线性关系；与羊常见病原菌无交叉反应，表明特异性较好；最低检测限为100 copies·μL^-1，比常规PCR高100倍；组内和组间变异系数均小于2%，表明具有良好的重复性和稳定性。鲜思美等^[15]、姚俊等^[16]和Gallina等^[17]分别建立了羊传染性脓疱病毒实时荧光定量PCR，其最低检测限分别为1 000、10、10 copies·μL^-1。本研究建立的方法在灵敏度上比鲜思美等^[13]高10倍，比姚俊等和Gallina等低10倍。前者所采用的方法与本试验一致，后两者所采用的方法为探针法，其灵敏性相对较好一些。

应用本研究建立的实时荧光定量PCR方法对39份临床样品进行检测，并与常规PCR法进行了比较，结果表明，本研究建立的实时荧光定量PCR方法比常规PCR法更加敏感，可以用于临床样品的准确快速检测。