Transcriptome Sequencing on Fruiting Body of Agaricus bisporus in Developing Stages
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摘要: 对双孢蘑菇As2796子实体发育4个不同阶段样品的转录组进行测序，并与双孢蘑菇参考基因组进行序列比对。共比对到9 207个转录本，发掘新基因393个，其中164个得到功能注释。基于比对结果进行各基因在不同样品中的表达量分析，识别差异表达基因，发现原基期与其他3个不同发育时期有316个共同差异基因。对差异基因进行功能注释和富集分析，可为进一步研究双孢蘑菇子实体生长发育的相关基因奠定基础。Abstract: Samples of Agaricus bisporus As2796 fruiting bodies in 4 developmental stages were collected for transcriptome sequencing. After aligned with the reference genome sequence of the mushroom, 9 207 transcripts were identified. Among them, 393 were new genes with 164 being functionally annotated. The expression level of the genes was analyzed to differentiate the samples. The alignments showed an overlapping of 316 differentially expressed genes between the primordium and the 3 other developmental stages. An analysis and function evaluation on these genes were performed for further study on the growth and development of A. bisporus fruiting body.
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近年来，中国双孢蘑菇的年产量达300多万t，年产值200多亿元人民币。作为我国多年来的双孢蘑菇主栽品种，As2796从1992年推广至今，在全国累计推广20多亿平方米，新增产值1 600多亿元人民币，出口创汇50多亿美元，产量、出口量约占同期全球50%，为中国双孢蘑菇产业规模从小到世界第一的跨越式发展提供了品种支撑[1]。荷兰ASM Sonnenberg也认为，中国双孢蘑菇产业规模庞大，中国自行选育的As2796等品种在国内市场占据支配地位[2]。本课题组前期开展的双孢蘑菇核心种质重测序结果表明，以As2796为代表的国内杂交菌株与以U1为代表的国外杂交菌株基因组差异很大，As2796系列与U1系列是世界上并列的两大双孢蘑菇杂交品系[3]。因此，As2796是世界上极具代表性的双孢蘑菇商业品种，对其转录组的测序有望发现系列新基因，可为进一步双孢蘑菇遗传育种工作提供相关的理论依据与分子工具。为此，本研究开展了双孢蘑菇As2796子实体4个不同发育阶段转录组分析研究。
1. 材料与方法
1.1 供试菌株
双孢蘑菇As2796由福建省农业科学院食用菌研究所种质资源与遗传育种研究室保藏并提供。供试样品采样参照文献[4]，采集该菌株子实体原基期(米粒大)、幼菇期(菌盖直径1 cm)、采收期(菌盖直径3～5 cm，菌膜未破裂)、开伞期(菌盖直径8～10 cm，菌盖展开)4个不同发育阶段样品，分别编号为T01、T02、T03、T04。将刚采下的子实体样品去除根部及污物，原基期和幼菇期取整粒，采收期和开伞期用无菌刀片取其纵切片，使样品包含菌盖、菌褶和菌柄组织。
1.2 试验方法
1.2.1 总RNA样品提取与检测
待测菌丝体样品经试剂盒提取总RNA，使用Nanodrop检测RNA的纯度(OD260/280)、浓度、核酸吸收峰是否正常；使用Agilent 2100精确检测RNA的完整性，检测指标包括：RIN值、28S/18S、图谱基线有无上抬、5S峰。
1.2.2 转录组测序
总RNA样品检测合格后，送交北京百迈客生物科技有限公司进行cDNA文库构建、质量检测，通过Illumina HiSeq高通量测序平台对文库进行测序，并对原始测序数据进行过滤，得到高质量的Clean Data。
1.2.3 生物信息学分析
利用TopHat2[5]将Clean Reads与指定的参考基因组进行序列比对，得到Mapped Reads；使用Cufflinks软件的Cuffquant和Cuffnorm组件，通过Mapped Reads在基因上的位置信息，采用FPKM[6](Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)作为衡量转录本或基因表达水平的指标，对转录本和基因的表达水平进行定量；通过对差异显著性P值(P-value)进行校正得到错误发现率(False Discovery Rate，FDR)，将Fold Change≥2且FDR<0.01作为筛选标准，使用EBSeq[7]进行差异分析，获得两个生物学条件之间的差异表达基因集，包括上调基因和下调基因。使用BLAST[8]软件将发掘的新基因及差异基因与NR[9]，Swiss-Prot[10]，GO[11]，COG[12]，KEGG[13]等数据库进行序列比对，进行功能注释和功能富集等表达水平分析。
2. 结果与分析
2.1 测序数据产出统计
各样品数据产出统计见表 1。经过测序质量控制，共得到18.56 Gb Clean Data，各样品Q30碱基百分比均不小于86.34%。将Clean Reads与参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息。从比对结果统计来看，各样品的Reads与参考基因组的比对效率在73.33%～76.86%，共比对到9 207个转录本。
表 1 样品测序数据及与所选参考基因组的序列比对结果Table 1. Statistical sequencing data and alignment of samples with reference genome样品 编号 所有Reads 比对上的Reads
(占比/%)GC含量
/%≥Q30比例
/%As2796原基期 T01 35, 666, 572 26, 745, 594 (74.99) 49.06 87.10 As2796幼菇期 T02 35, 313, 022 27, 062, 540 (76.64) 49.39 86.34 As2796采收期 T03 38, 280, 048 29, 421, 017 (76.86) 49.27 86.59 As2796开伞期 T04 38, 250, 636 28, 047, 724 (73.33) 49.55 86.57 2.2 新基因挖掘
基于所选参考基因组序列对Mapped Reads进行拼接，并与原有的基因组注释信息进行比较，寻找原来未被注释的转录区，发掘该物种的新转录本和新基因，从而补充和完善原有的基因组注释信息。过滤掉编码的肽链过短(少于50个氨基酸残基)或只包含单个外显子的序列，共发掘393个新基因。将发掘的新基因与各数据库进行序列比对，获得新基因的注释信息。最终得到各数据库注释的新基因数量统计(表 2)，共有164个基因得到注释。
表 2 双孢蘑菇As2796子实体不同发育阶段新基因功能注释结果Table 2. Statistics on annotated new genes of A. bisporus As2796 fruiting bodies at different developmental stages用于注释的数据库 获注释的新基因数目 COG 10 GO 11 KEGG 15 Swiss-Prot 15 nr 164 All 164 2.3 差异表达基因分析
从获得的差异表达基因集基因数目统计(表 3)可以看出，随着双孢蘑菇As2796子实体的生长和成熟，幼菇期、采收期、开伞期分别与原基期相比较的差异基因数目相应增加，分别为703、891和953个，其中下调表达的差异基因数目均比上调表达的多。维恩图(图 1)显示原基期与其余3个不同发育时期样品有316个共同差异基因。
表 3 双孢蘑菇As2796子实体不同发育阶段与原基期相比的差异表达基因数目统计Table 3. Number of differentially expressed genes of A. bisporus As2796 fruiting bodies at primordium and other developmental stages差异表达基因集 所有DEG 上调表达DEG 下调表达DEG T01_vs_T02 703 199 504 T01_vs_T03 891 266 625 T01_vs_T04 953 433 520 ![]()
图 1 双孢蘑菇As2796子实体不同发育阶段与原基期相比的差异表达基因数目韦恩图Figure 1. Venn diagram on number of differentially expressed genes of A. bisporus As2796 fruiting bodies at primordium and other developmental stages对差异基因进行初步筛选，获得了系列在4个发育阶段中连续上调或下调表达的差异基因。由于差异基因数目较多，本研究仅重点列出了从原基期到开伞期4个发育阶段中基因相对表达量FPKM从0.2以下的痕量水平连续上调表达的差异基因(No.1～5)以及连续下调表达至0.2以下痕量水平的差异基因(No.6～12)(表 4), 其中No.11为疏水蛋白-3(Hydrophobin-3)前体，No.2可能为蚯蚓血红蛋白(hemerythrin)相似的蛋白质，No.5和No.6分别参与细胞壁(膜)发生、蛋白质翻译生物学过程，其余均为未知的新基因或假想蛋白。
表 4 双孢蘑菇As2796子实体不同发育阶段与原基期相比连续上下调差异表达部分基因Table 4. Part of differentially expressed genes up-or down-regulated continuously of A. bisporus As2796 fruiting bodies at primordium and other developmental stages编号 基因ID 相对表达量FPKM 基因长度/bp 基因注释 T01 T02 T03 T04 1 estExt_fgenesh2_pg.C_140114 0.00 4.27 5.60 13.66 1070 hypothetical protein AGABI2DRAFT_181292 2 estExt_Genewise1.C_120616 0.12 1.39 8.59 28.39 761 Uncharacterized hemerythrin-like protein C869.06c 3 estExt_fgenesh2_pg.C_70433 0.12 0.16 0.55 5.85 2232 hypothetical protein AGABI2DRAFT_179499 4 e_gw1.3.1046.1 0.14 0.44 0.95 3.13 1326 hypothetical protein AGABI2DRAFT_65418 5 fgenesh2_kg.4_668_2_898_CFAF_CFAG_CFAH_EXTA 0.20 2.96 6.50 8.17 603 Cell wall/membrane/envelope biogenesis 6 estExt_fgenesh2_kg.C_10169 24.02 15.49 6.72 0.00 925 Translation, ribosomal structure and biogenesis 7 Agaricus_newGene_232 15.09 4.80 0.77 0.00 510 hypothetical protein AGABI1DRAFT_132181 8 Agaricus_newGene_387 10.56 6.96 0.68 0.00 460 Null 9 Agaricus_newGene_471 15.32 0.61 0.11 0.00 883 Null 10 estExt_fgenesh2_kg.C_70465 2.33 1.93 0.76 0.00 1908 hypothetical protein AGABI2DRAFT_193962 11 fgenesh2_kg.9_95_2_1845_CFAF_CFAG_CFAH_EXTA 9.85 3.61 0.00 0.00 665 Hydrophobin-3 (Precursor) 12 fgenesh2_pm.14_33 25.79 5.37 1.72 0.00 447 hypothetical protein AGABI2DRAFT_154209 2.4 差异表达基因功能注释
对差异表达基因进行5个数据库的功能注释，各差异表达基因集注释到的基因数量统计见表 5，原基期与其余3个不同发育时期的差异基因获得注释的数目分别为676、862、928个，表明大多数差异基因获得了注释信息。
表 5 注释的差异表达基因数量统计Table 5. Statistics of annotated differentially expressed genes差异表达基因集 差异表达基因总数 各数据库注释到的差异表达基因数 COG GO KEGG NR Swiss-Prot T01_vs_T02 676 289 242 156 676 351 T01_vs_T03 862 352 306 194 862 435 T01_vs_T04 928 393 364 265 928 490 利用COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)数据库对差异基因产物进行直系同源分类，发现原基期与其他3个时期相比的差异基因表达产物主要集中在能量产生与转换、氨基酸转运与代谢、碳水化合物转运与代谢、脂质转运与代谢，以及次级代谢产物生物合成、转运与分解等方面。图 2为幼菇期与原基期差异表达基因的COG分类，显示以上5类基因产物占比分别为6.09%、13.58%、10.54%、8.9%、10.77%。这些功能对双孢蘑菇子实体的发育与成熟可能起着重要作用。
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图 2 双孢蘑菇As2796子实体幼菇期与原基期差异表达基因的COG分类Figure 2. COG annotation of differentially expressed genes between young and primordium stages of A. bisporus As2796 fruiting bodies对差异表达基因KEGG的注释结果按照KEGG中通路类型进行分类，发现3个时期与原基期相比较的差异表达基因KEGG通路中，开伞期多出了DNA复制(DNA replication)、碱基切除修复(Base excision repair)、碱基错配修复(Mismatch repair)、RNA转运(RNA transport)、核糖体(Ribosome)等相关通路，特别是核糖体通路数目特异性增加显著，达36个，在所有通路类型中占比为20.81%。图 3显示了开伞期与原基期相比差异基因KEGG通路类型。
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图 3 双孢蘑菇As2796子实体开伞期与原基期相比差异基因KEGG通路类型Figure 3. KEGG pathway types of differentially expressed genes between opening and primordium stages of A. bisporus As2796 fruiting bodies3. 讨论
双孢蘑菇H97参考基因组注释到10 438个基因[14]，基因表达具有时间和空间特异性，在不同条件下，存在表达水平存在显著差异的基因(DEG)或转录本(DET)。本次转录组测序为双孢蘑菇As2796子实体发育不同阶段的4个样品，共比对到9 207个转录本，比H97参考基因组注释到的基因数目略低，可能是部分基因在所检测的4个阶段中没有转录的原因。通过生物信息学分析，已经发现了一批在双孢蘑菇子实体发育不同阶段差异表达显著的基因并获得了它们的注释，一些基因的表达量倍数差异达到数百倍甚至上千倍，它们的相关功能值得进行深入分析。
吴小梅等[15]之前对双孢蘑菇原基期、采收期和开伞后期样品进行了转录组测序比较，KEGG功能富集分析表明差异基因参与了氨基酸代谢、碳水化合物代谢、核苷酸代谢、脂类代谢和能量代谢五大代谢通路。本研究对差异基因产物的COG分类结果表明它们按比例大小主要集中在氨基酸转运与代谢、次级代谢产物生物合成与分解、碳水化合物转运与代谢、脂质转运与代谢、能量产生与转换等方面。二者从不同的分析角度得出相似的结果。根据差异基因的相对表达量FPKM值，吴小梅等[15]列出了双孢蘑菇3个发育阶段FPKM>15的显著差异表达的18个基因，本研究则筛选出了双孢蘑菇4个发育阶段中基因FPKM值从痕量水平连续上调表达的差异基因以及连续下调表达至痕量水平的差异基因，从不同角度对重要的差异基因进行了注释与探讨。
在4个发育阶段疏水蛋白-3(Hydrophobin-3)前体表现为连续下调表达至痕量水平，与之前用蛋白质组学技术分析双孢蘑菇发育与采后后熟样品中发现的疏水蛋白-B在发育早期表达量较高而在发育后期及采后后熟时期呈连续下调表达至痕量水平具有一致的趋势[4, 16]，说明疏水蛋白在双孢蘑菇子实体发育与后熟过程中确实具有重要的作用[17-19]，可以作为双孢蘑菇发育与成熟阶段划分的一个指标。我们还发现之前在不同发育阶段蛋白质组学分析[4]中呈连续上调表达的错配碱基识别蛋白(mismatched base pair and cruciform DNA recognition protein)在本次转录组测序中趋势完全一致，在4个发育阶段中该基因(Gene ID: fgenesh2_kg.10_22_2_2586_CFAF_CFAG_CFAH_EXTA)FPKM值分别为57、1902、2082、132742。这是一类在DNA修复过程中起重要作用的蛋白质，在双孢蘑菇发育后期的大量表达，保证了孢子形成过程中涉及的大量减数分裂和有丝分裂中DNA复制的准确性。在与原基期比较的差异表达基因KEGG通路类型分析中，开伞期比其他2个时期多出了DNA复制、碱基修复、RNA转运、核糖体等相关通路，也从另一方面验证了双孢蘑菇子实体成熟和开伞过程中DNA复制大幅增加的事实。以上结果说明双孢蘑菇蛋白质组iTRAQ-MS/MS分析与转录组测序可以相互印证，增加结果的可靠性。
为此，今后将对这些差异基因作进一步筛选，深入分析与验证这些差异基因是否与双孢蘑菇子实体生长与发育相关，特别是As2796与国外工厂化专用品种不同的、生长发育均衡适于农业长周期生产的相关发育基因，探讨双孢蘑菇子实体生长发育的分子机理，以指导双孢蘑菇遗传育种工作。
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图 1 双孢蘑菇As2796子实体不同发育阶段与原基期相比的差异表达基因数目韦恩图
Figure 1. Venn diagram on number of differentially expressed genes of A. bisporus As2796 fruiting bodies at primordium and other developmental stages
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图 2 双孢蘑菇As2796子实体幼菇期与原基期差异表达基因的COG分类
Figure 2. COG annotation of differentially expressed genes between young and primordium stages of A. bisporus As2796 fruiting bodies
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图 3 双孢蘑菇As2796子实体开伞期与原基期相比差异基因KEGG通路类型
Figure 3. KEGG pathway types of differentially expressed genes between opening and primordium stages of A. bisporus As2796 fruiting bodies
表 1 样品测序数据及与所选参考基因组的序列比对结果
Table 1 Statistical sequencing data and alignment of samples with reference genome
样品 编号 所有Reads 比对上的Reads
(占比/%)GC含量
/%≥Q30比例
/%As2796原基期 T01 35, 666, 572 26, 745, 594 (74.99) 49.06 87.10 As2796幼菇期 T02 35, 313, 022 27, 062, 540 (76.64) 49.39 86.34 As2796采收期 T03 38, 280, 048 29, 421, 017 (76.86) 49.27 86.59 As2796开伞期 T04 38, 250, 636 28, 047, 724 (73.33) 49.55 86.57 
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表 2 双孢蘑菇As2796子实体不同发育阶段新基因功能注释结果
Table 2 Statistics on annotated new genes of A. bisporus As2796 fruiting bodies at different developmental stages
用于注释的数据库 获注释的新基因数目 COG 10 GO 11 KEGG 15 Swiss-Prot 15 nr 164 All 164
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表 3 双孢蘑菇As2796子实体不同发育阶段与原基期相比的差异表达基因数目统计
Table 3 Number of differentially expressed genes of A. bisporus As2796 fruiting bodies at primordium and other developmental stages
差异表达基因集 所有DEG 上调表达DEG 下调表达DEG T01_vs_T02 703 199 504 T01_vs_T03 891 266 625 T01_vs_T04 953 433 520
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表 4 双孢蘑菇As2796子实体不同发育阶段与原基期相比连续上下调差异表达部分基因
Table 4 Part of differentially expressed genes up-or down-regulated continuously of A. bisporus As2796 fruiting bodies at primordium and other developmental stages
编号 基因ID 相对表达量FPKM 基因长度/bp 基因注释 T01 T02 T03 T04 1 estExt_fgenesh2_pg.C_140114 0.00 4.27 5.60 13.66 1070 hypothetical protein AGABI2DRAFT_181292 2 estExt_Genewise1.C_120616 0.12 1.39 8.59 28.39 761 Uncharacterized hemerythrin-like protein C869.06c 3 estExt_fgenesh2_pg.C_70433 0.12 0.16 0.55 5.85 2232 hypothetical protein AGABI2DRAFT_179499 4 e_gw1.3.1046.1 0.14 0.44 0.95 3.13 1326 hypothetical protein AGABI2DRAFT_65418 5 fgenesh2_kg.4_668_2_898_CFAF_CFAG_CFAH_EXTA 0.20 2.96 6.50 8.17 603 Cell wall/membrane/envelope biogenesis 6 estExt_fgenesh2_kg.C_10169 24.02 15.49 6.72 0.00 925 Translation, ribosomal structure and biogenesis 7 Agaricus_newGene_232 15.09 4.80 0.77 0.00 510 hypothetical protein AGABI1DRAFT_132181 8 Agaricus_newGene_387 10.56 6.96 0.68 0.00 460 Null 9 Agaricus_newGene_471 15.32 0.61 0.11 0.00 883 Null 10 estExt_fgenesh2_kg.C_70465 2.33 1.93 0.76 0.00 1908 hypothetical protein AGABI2DRAFT_193962 11 fgenesh2_kg.9_95_2_1845_CFAF_CFAG_CFAH_EXTA 9.85 3.61 0.00 0.00 665 Hydrophobin-3 (Precursor) 12 fgenesh2_pm.14_33 25.79 5.37 1.72 0.00 447 hypothetical protein AGABI2DRAFT_154209
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表 5 注释的差异表达基因数量统计
Table 5 Statistics of annotated differentially expressed genes
差异表达基因集 差异表达基因总数 各数据库注释到的差异表达基因数 COG GO KEGG NR Swiss-Prot T01_vs_T02 676 289 242 156 676 351 T01_vs_T03 862 352 306 194 862 435 T01_vs_T04 928 393 364 265 928 490
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百度学术
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