密码子是生物体中基因编码蛋白质的基本结构单元，自然界中大部分氨基酸均对应多个密码子，即为同义密码子(Synonymous codon)。物种长期进化过程中由于环境适应性改变往往倾向使用特定的密码子，从而形成密码子使用偏性(Codon bias)。目前，密码子使用偏性的形成机制研究较多，且普遍认为突变压力和选择效应是最关键作用力^[1-3]。而密码子使用偏性能够反映物种或基因的起源和进化规律，对基因表达、蛋白质翻译和蛋白质结构功能等研究具有重要参考价值。

香蕉是我国热带亚热带地区重要果树，而寒害是制约我国香蕉产业健康发展的重要因素之一，因此开展香蕉抗寒机制研究具有重要的现实意义^[4]。研究认为，野生蕉具有更高的抗寒能力，而脂肪酸去饱和酶(fatty acid ω-3 desaturase，FAD)作为植物抗寒第一道防线，在野生蕉的抗寒过程中起到了关键作用^[5-7]。目前，野生蕉FAD的研究主要集中在基因成员的克隆分离和表达分析方面，其密码子使用偏性研究尚未见报道。为进一步分析该基因的结构特征和可能的表达调控功能，试验以克隆获得的福州旗山野生蕉(Musa itinerans)FAD7为研究对象，采用CodonW、EMBOSS、MEAG5.0和SPSS19.0等软件进行密码子使用偏好性分析，同时和芭蕉属品种、其他单/双子叶植物FAD7以及模式生物基因组密码子使用偏性进行比较分析，并进行蛋白质异源表达受体系统筛选，以期为野生蕉FAD7后续研究提供科学依据。

1.   材料与方法

1.1   基因序列获得

供试FAD7从福州旗山野生蕉中克隆获得，包含ORF 1 371 bp，编码456个氨基酸，GenBank登录号为JX 911314.1。以FAD7为关键词从GenBank中搜索并下载其他芭蕉属品种、单/双子叶植物FAD7序列；模式生物大肠杆菌Escherichia coli和酵母菌Saccharomyces cerevisiae的基因组密码子偏性数据来源于Codon Usage Database在线数据库。

1.2   方法

有效密码子数(ENc)、密码子GC含量(GC)、密码子第3位G/C含量(GC3s)、同义密码子相对使用度(RSCU)等密码子偏性参数参照时慧等^[8]和郭秀丽等^[9]的方法进行计算；野生蕉FAD7最优密码子使用频率采用CUSP运算；采用MEGA5.0和SPSS19.0(欧式平方距离ward法)分别基于核酸序列和同义密码子相对使用度进行物种间FAD7聚类分析。

2.   结果与分析

2.1   野生蕉FAD7密码子偏性分析

2.1.1   有效密码子数和GC含量

ENc是密码子偏性的重要指标，其取值范围介于20~61，随着取值的增大基因密码子偏性和可能的表达水平逐渐减弱，通常取35作为密码子偏性强弱的标准^[10]。试验中，野生蕉FAD7的ENc值为54.78，表明该基因密码子使用偏性较弱，且可能的表达水平较低。进一步分析发现，野生蕉FAD7的GC含量和GC3s分别为0.539和0.558，表明该基因编码氨基酸时密码子组成成分和密码子碱基第3位均偏好使用G或C。

2.1.2   同义密码子相对使用度

野生蕉FAD7同义密码子相对使用度如表 1所示，其使用偏性较强的密码子个数达为30(RSCU > 1.0)，其中野生蕉FAD7对CUC、CAG和AGG的偏好性极为明显(RSCU > 2.0)，而密码子GUA和CAA并不参与该基因氨基酸编码(RSCU = 0)。在偏好性相对较强的密码子中，G或C结尾的达到18个，占总数的60%。由此也说明，野生蕉FAD7密码子偏好选择G或C。

表  1  野生蕉FAD7同义密码子相对使用度

Table  1.  RSCU of FAD7 in M. itinerans

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2.2   物种间FAD7密码子偏性分析

2.2.1   有效密码子数和GC含量

为进一步验证物种间FAD7的密码子偏好性，试验对单子叶植物和双子叶植物的密码子偏性参数进行比较，结果如表 2所示。不同类型植物之间FAD7的ENc值没有显著差异，双子叶植物大豆最低，仅为44.08，密码子使用偏性最强，而马齿苋最高，达到55.40。而在最优密码子使用频率上，6种单子叶植物高于双子叶植物。物种间FAD7密码子组成成分分析发现，双子叶植物明显偏好使用A或T，且偏好以A或T结尾，而单子叶植物则完全相反。研究结果表明，物种间FAD7密码子偏好性普遍较弱，与物种种类并不相关，而密码子碱基的组成与物种有关，单子叶植物偏好使用G或C，而双子叶植物偏好使用A或T。结果也说明FAD7在不同类型植物中可能存在不同的进化方式。

表  2  物种间FAD7密码子偏性参数

Table  2.  Codon bias of FAD7s in various plants

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2.2.2   基于密码子偏好性和CDS序列的FAD7聚类分析

密码子偏好性往往能够体现物种间基因的进化和亲缘关系。试验基于密码子偏好性和CDS序列对FAD7聚类模式进行比较，结果如图 1所示。基于密码子使用偏性和核酸序列均按照单双子叶植物类型划分为两大类，表明FAD7在单子叶植物和双子叶植物中确实存在显著差异，也进一步验证该基因在不同类型植物中可能存在不一样的进化方式。然而在双子叶植物亚类群聚类中，二者的聚类结果并非完全一致，说明双子叶植物密码子偏好性可能更为复杂。

图  1  基于密码子偏好性(A)和核酸序列(B) FAD7系统发育树分析

Figure  1.  Cluster analysis on FAD7s by codon bias (A) and CDS (B) in various plants

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2.3   野生蕉FAD7异源表达受体系统选择

密码子偏性参数是植物异源表达受体系统筛选的重要参考标准，通常认为密码子使用频率比值小于0.5或大于2.0时，物种间存在密码子偏性差异。野生蕉FAD7与大肠杆菌(Ec)和酵母菌(Sc)基因组偏性差异较大的密码子个数分别为22和27，可见，大肠杆菌可能为该基因蛋白质异源表达较为理想的受体系统(表 3)。然而，试验也发现野生蕉FAD7和该宿主基因组之间仍存在较大差异，例如AGG，二者比值达到11.52，而在CAA和GTA上二者的比值为0，说明在异源表达时仍需要对这些密码子进行优化和改造。

表  3  野生蕉FAD7和模式生物基因组密码子偏性比较

Table  3.  Comparison of codon biases in FAD7s of M. itinerans and genomes of model organisms

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3.   讨论

基因密码子使用偏性是物种在长期进化过程中逐步形成的，主要来源于突变压力和选择效应。此外，研究表明密码子偏好性与基因的功能和表达水平密切相关，偏好性越高则表达水平也越高^[11-12]。试验中，野生蕉FAD7的ENc值为54.78，明显高于35而接近61，可见该基因密码子使用偏性较弱，其表达水平可能较低，然而在不同植物中FAD7又存在较大差异，其中大豆中最高，而马齿苋中最低，说明FAD7介导的植物抗寒作用存在物种差异性。而在密码子组成成分上，野生蕉FAD7偏好使用G+C且偏好密码子以G或C结尾，符合单子叶植物的密码子使用特性^[13]。从进化上分析，根据November^[14]和赖瑞联等^[15]研究结论，野生蕉FAD7 AT到GC的突变压力高于GC到AT的突变压力。

Zhou等^[16]和时慧等^[8]研究认为，亲缘关系较近的物种往往具有相似的密码子使用偏性。试验研究发现，单子叶植物和双子叶植物间FAD7之间存在严格的密码子使用偏性规律，尤其在密码子使用频率和密码子组成成分上差别明显。而在聚类分析中，基于密码子偏好性和核酸序列也将FAD7分为单子叶植物和双子叶植物两个大类，说明该基因密码子偏好性与基因序列存在较为平行的进化过程。而这种现象在PPDK^[17]、NAD-ME^[18]和ICE1^[8]等基因中也有类似研究。

此外，试验主要通过密码子使用偏好性分析认为大肠杆菌原核表达受体系统可作为野生蕉FAD7理想蛋白质表达试验体系，然而研究也发现野生蕉FAD7和大肠杆菌之间部分密码子使用偏性仍存在较大差异，后期试验中仍需对其进行优化和改造。该研究结果为野生蕉FAD7后续研究提供了重要科学依据。