中草药及其多糖提取物作为新型绿色免疫增强剂因其毒性低、无污染、无耐药性和药物残留，并具有广泛的抗菌、抑菌作用等特点，在水产研究与应用中成为新的热点。研究表明，免疫增强剂可激活嗜中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬，破坏异物颗粒；刺激淋巴细胞的增生或分泌淋巴因子；诱导抗体的产生及补体的生成^[1-3]。对黄颡鱼、异育银鲫、银鲫、中华鳖等水产动物的免疫功能都有促进作用^[4-7]。

向桢^[8]研究表明复方乌梅可显著提高鲤鱼攻毒后的存活率、红细胞数和NBT阳性细胞数，以及提高鲤鱼淋巴细胞的吞噬活性；刘铁铮^[9]研究的中草药复方对鲤鱼的非特异性免疫及细胞免疫均有明显的促进作用；苏岭^[10]研制的中草药复方AH能显著提高鲤鱼血清中碱性磷酸酶、补体C₃、补体C₄、免疫球蛋白IgM的含量。但迄今为止未见太子参多糖对福瑞鲤非特异性免疫调节作用及抗病力的研究报道。

本研究以福瑞鲤为研究对象，通过在基础饲料中添加不同水平的太子参多糖，检测分析其血液血清溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(AKP)、碱性磷酸酶(ACP)、补体C₃、抗病力等指标，探讨太子参多糖对福瑞鲤非特异性免疫功能的作用及抗病力的影响，以期为深入研究中草药多糖类物质在水产上的应用积累基础数据。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   太子参多糖

太子参多糖由福建省中医药大学药学院分离、提取与纯化。

1.1.2   试验鱼及饲养

供试福瑞鲤(FFRC Strain Common Carp)由大宗淡水鱼类产业技术体系福州综合试验站提供，体质量约50.0 g，数量250尾。暂养于0.60 m³体积的水箱里，25℃水温，连续充气，每天投饵1次，投饵量为鱼体质量的3%~5%，每天换水1次，暂养一周后使用。

1.1.3   基础饲料

厦门通威饲料有限公司生产的淡水鱼育成浮性配合饲料，其营养成分为粗蛋白质≥28.0%，粗脂肪≥2.0%，粗纤维≤10.0%，粗灰分≤15.0%，钙0.4%~1.50%，总磷≥0.7%，食盐0.30%~1.50%，水分≤12.5%。

1.2   饲料的制备

淡水鱼育成浮性配合饲料研成粉状，基础饲料粉末按质量比加入太子参多糖分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.5%，混匀后, 利用小型颗粒饲料机加工成直径约5 mm的颗粒饲料，烘干设备使饲料的含水量低于10%，密封保存备用。

1.3   福瑞鲤的分组与投喂

将试验鱼分成5组，即1个空白对照组和4个太子参多糖试验组，每组50尾。第1组为空白对照组：投喂基础饲料；第2组至第5组为太子参多糖试验组，投喂太子参多糖饲料，饲料中按质量比加入太子参多糖分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.5%；各组试验鱼每天投喂1次，饲料投喂量为鱼体重的5%，并于初次投喂后的第35 d时采集血样检测，每个免疫指标检测7个样本，并进行抗病力测定。

1.4   血清溶菌酶(LZM)含量的测定

血清LZM含量的测定参照溶菌酶检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所；产品编号：A050-1)，血清溶菌酶含量按下式计算：溶菌酶含量/(μg·mL^-1)=(测定管透光度自透光度UT₂-测定管透光度UT₀)/(标准管透光度ST₂-标准管透光度ST₀)×200 U·mL^-1 ×样本测试前稀释倍数，其中UT₀为测定管加应用菌液反应5 s时的透光度，UT₂为测定管加应用菌液反应125 s时的透光度，ST₀为标准管加应用菌液反应5 s时的透光度，ST₂为标准管加应用菌液反应125 s时的透光度。

1.5   血清超氧化物歧化酶活性(SOD)活性的测定

血清SOD的测定参照SOD WST-1法检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所；产品编号：A001-3)，血清SOD活力按下式计算：SOD抑制率/%=[(A_对照-A_对照空白)-(A_测定-A_测定空白)]×100/(A_对照-A_对照空白)；SOD活力/(U·mL^-1)= SOD抑制率/%÷50%×反应体系稀释倍数×样本测试前稀释倍数。

1.6   血清酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性的测定

酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)的测定参照ACP、AKP检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所；产品编号分别为：A060和A059-1)，ACP活力按下式计算：ACP(U/100 mL)= (测定管吸光度/标准管吸光度)×标准管含酚的量×(100 mL/0.05 mL)，AKP活力计算方法同ACP。

1.7   补体C₃含量检测

参照补体C₃检测试剂盒(双抗夹心ELISA法)(购自南京建成生物工程研究所；产品编号：H186) 测定试验福瑞鲤的血清补体C₃。

1.8   抗病力的测定

于初次投喂多糖饲料后的第35 d，设置平行试验组2组，各试验组取11尾福瑞鲤做攻毒试验，攻毒菌株为NA固体培养基培养16 h的嗜水气单胞菌Js70322NA(浓度为7.5×10⁷cfu·mL^-1)，观察14 d后，计算相对保护率，对照组亦同。分析试验鱼体的抗病力情况。相对保护率(Relative Protective Rates)按下列公式计算：RPR=[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%。

1.9   数据处理与方差分析

应用Excel软件对数据进行处理，结果以平均值±标准差(X±SD)表示；采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，进行组间差异比较。

2.   结果与分析

2.1   太子参多糖对福瑞鲤血清溶菌酶含量的影响

太子参多糖各试验组血清溶菌酶含量从第2组到第5组逐渐增加，均比第1组(空白对照组)高(表 1)，其中第2组与对照组有显著差异(P < 0.05)，第3、4、5试验组与对照组有极显著差异(P < 0.01)，各试验组间无显著差异。第5组血清溶菌酶含量最高，数值为0.175 7 μg·mL^-1。

表  1  福瑞鲤血清溶菌酶含量

Table  1.  LZM in serum of FFRC strain common carps

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2.2   太子参多糖对福瑞鲤血清SOD活性的影响

太子参多糖各试验组血清SOD活性均高于空白对照组，第3组、第4组与第5组与空白对照组差异显著(P < 0.05)，其中第4组SOD活性最高，为417.79 U·mL^-1，其次为第5组，为414.90 U·mL^-1，第3组SOD活性为413.93 U·mL^-1，第2组SOD活性最小，为403.96 U·mL^-1，各试验组间差异不显著(表 2)。

表  2  福瑞鲤血清SOD活性

Table  2.  Serum SOD activity of FFRC strain common carps

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2.3   太子参多糖对福瑞鲤血清ACP和AKP活性的影响

太子参多糖各试验组ACP活性与空白对照组比较差异极显著(P < 0.01)(表 3)，第5组ACP活性最高，为每100 mL14.873 4 U，第2组ACP活性最小，为每100 mL12.61 U；第3组、第4组、第5组AKP活性与空白对照组差异极显著(P < 0.01)，第2组AKP活性与对照组差异不显著，第4组的AKP活性最高，为每100 mL10.738 4 U。

表  3  福瑞鲤血清ACP和AKP活性

Table  3.  Serum ACP and AKP activities of FFRC strain common carps

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2.4   太子参多糖对福瑞鲤血清补体C₃含量的影响

太子参多糖各试验组血清补体C₃含量与空白对照组相比，均存在极显著差异(P < 0.01)，见表 4，第4组的血清补体C₃含量最高，数值为0.115 7 g·L^-1，其次分别为第3组和第5组，血清补体C₃含量最小的为第2组，数值为0.096 3 g·L^-1。

表  4  福瑞鲤血清补体C₃含量测定

Table  4.  Serum complement C₃ content of FFRC strain common carps

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2.5   太子参多糖对福瑞鲤抗病力的测定

福瑞鲤攻毒试验后，观察鱼的状态，统计累计死亡数量，14 d后计算太子参多糖对福瑞鲤的免疫保护率，空白对照组鱼全部死亡，免疫保护率最高的为第4、5试验组，均为54.55%，第3组的保护率为45.45%，第2组的保护率为36.36%。结果说明太子参多糖对福瑞鲤有较好的免疫保护率，能提高福瑞鲤的抗病力(图 1、2)。

图  1  太子参多糖对福瑞鲤免疫保护率

Figure  1.  Relative protective rate of R. pseudostellariae polysaccharides for FFRC strain common carps

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图  2  嗜水气单胞菌攻毒后福瑞鲤累计死亡数

注：a、b、c、d、e分别代表第1、2、3、4、5组。

Figure  2.  Cumulative mortality of immunized FFRC strain common carps against live A. hydrophila

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3.   讨论与结论

硬骨鱼类已具有较为完整的免疫系统，非特异性免疫系统与特异性的免疫功能完善。用中草药免疫增强剂防治鱼类疾病，不但可以杀灭病原，还能起到促进鱼体健康、增强免疫力的作用。研究表明枸杞多糖^[4]、茯苓多糖^[5]、黄芪多糖^[7]、复方乌梅^[8]、多种中药组方^[9-10]对水产动物免疫功能，特别是非特异性免疫有促进作用。本研究利用太子参多糖免疫增强剂免疫福瑞鲤，太子参多糖试验组血清的LZM含量、ACP和AKP活性、补体C₃含量，剂量高于0.2%的3个太子参多糖试验组与空白对照组相比均有极显著差异(P < 0.01)；太子参多糖试验组的血清SOD活性，剂量高于0.2%的3个太子参多糖试验组与空白对照组相比差异显著(P < 0.05)。试验表明太子参多糖显著增强了福瑞鲤的非特异性免疫功能。利用嗜水气单胞菌进行攻毒试验，受免福瑞鲤免疫保护率达36.36%~54.55%，说明太子参多糖通过加强鱼体的免疫功能，有效提高了福瑞鲤的抗病能力。

本研究对福瑞鲤免疫指标检测过程中，发现SOD活性、AKP活性、补体C₃含量3个指标，0.5%太子参多糖试验组比0.3%太子参多糖试验组数值小的情况，但差异不显著。针对这种随着多糖投喂剂量增强，免疫指标下降的原因有很多，王艳等^[6]分析当果寡糖的添加量4 000 mg·kg^-1饲料时，血液白细胞的吞噬活性、血清溶菌酶和血清SOD酶活性较1 000 mg·kg^-1、2 000 mg·kg^-1试验组下降，原因可能是过量的果寡糖，限制了肠道部分有益菌的增殖，进而影响到机体的免疫机能；聂国兴等^[11]认为木聚糖酶添加水平过高导致肠道食糜黏度过低，故1 500 mg·kg^-1组免疫指标低于500 mg·kg^-1组和1 000 mg·kg^-1组。0.5%太子参多糖试验组相对于0.3%太子参多糖试验组免疫指标减小的原因，谢忠毅^[12]的研究表明0.5%太子参多糖试验组福瑞鲤前、中、后肠的肠道内黏液细胞数量均比0.3%太子参多糖试验组少，这说明当太子参多糖投喂量达到一定程度后，对福瑞鲤肠道黏液细胞的数量和肠道免疫能力有不利影响，导致相关的免疫指标下降。

通过设置免疫多糖的给药剂量梯度，分析受免鱼体免疫功能提高情况，可为免疫多糖增强剂应用于养殖生产提供重要依据。免疫多糖适合的添加剂量跟多糖的种类和免疫对象相关联，添加的剂量差异也比较明显，刘云等^[13]研究建议海藻硫酸多糖和壳聚糖可作为刺参免疫增强剂使用，其适宜添加量分别为10 000 mg·kg^-1海藻硫酸多糖、20 000 mg·kg^-1壳聚糖；殷海成^[14]试验证明酵母免疫多糖的适宜添加水平为3 000 mg·kg^-1。本研究通过对太子参多糖投喂的福瑞鲤进行免疫功能分析表明，太子参多糖按质量比0.1%剂量投喂虽然各项指标均比对照组高，但血清SOD活性、AKP活性差异没有达到显著水平。而太子参多糖饲料按质量比0.2%、0.3%、0.5%剂量投喂，各项免疫指标均比对照组显著提高，其中0.3%投喂量在AKP、补体C₃、免疫保护率等指标均最高。结合免疫饲料成本因素，建议太子参多糖饲料最佳投喂质量比为0.3%，即每千克基础饲料中加入太子参多糖为3 000 mg。