The Dynamic Change of Gene Expression from Pinus massoniana in Response to Bursaphelenchus xylophilus Infestation
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摘要: 松材线虫病是一种严重危害马尾松生长的流行性病害，可导致马尾松枯萎死亡。为揭示该过程中基因的表达变化行为，本研究利用荧光定量PCR技术检测了松材线虫侵染不同天数下的马尾松较其对照样本中病原识别、抗逆调节、次生代谢、解毒作用及生长素响应等相关基因的表达变化。结果显示，除了与病原识别相关的CC-NBS-LRR抗性蛋白基因的表达随侵染天数的增加而增强之外，其他基因则在侵染2 d的马尾松样本中的表达水平最高，且明显高于未受侵染的对照马尾松样本，随后在侵染3天的马尾松中的表达又低于对照样本。此外，黄酮-3-羟化酶和细胞色素P450基因的表达随着侵染虫量的增加呈先上调后下调的变化方式。通过本研究初步揭示了马尾松响应松材线虫侵染的基因表达变化模式。Abstract: Pine wilt disease (PWD) is a devastating disease, which affects on the growth of masson pine (Pinus massoniana), often leading to withering and death. To reveal the change of gene expression pattern on this process, the gene dynamic expression from the P. massoniana infestation with nematode (Bursaphelenchus xylophilus) for 1, 2, and 3 days was studied. The genes, which were relevant to pathogen recognize, stress regulation, secondary metabolism, detoxification, and auxin-response were concerned. The results showed that most of the tested genes were presented highest expression level on the P. massoniana with infestation for two days, it was then down-regulated on these groups with 3-day infestation. Besides, the gene expression of CC-NBS-LRR resistance protein was continually increased in the treated P. massoniana compared with the corresponding control group. Additionally, genes expression of flavonoid 3-hydroxylase and cytochrome P450 were firstly up-regulated and then down-regulated on the P. massoniana respectively infected by graded increasing nematode qualities. The current findings preliminarily revealed the gene expression pattern on the P. massoniana in response to B. xylophilus infestation.
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Keywords:
- Pinus massoniana /
- Bursaphelenchus xylophilus /
- gene expression /
- disease response
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松材线虫病(Pine wilt disease)又称松树萎蔫病，是松树的一种毁灭性流行病。自1982年传入我国大陆以来，该病的扩散速度和发生范围越来越大，至2016年已在我国福建、广东、广西、浙江、重庆等15个省(自治区、直辖市)发生危害，并较2015年新增25个疫情县(市，区)(国家林业局2016年第6号公告)。据不完全统计，中国有超过5 000万株松树死于松材线虫病，年均发生面积达6万hm2，全部经济损失近300亿元[1]。因此，研究如何建立持久有效的方法防控松材线虫病是生产上急需解决的重大问题。
随着现代生物学技术的不断发展，借助分子遗传学理论与技术，在明确林木抗病相关机制的基础之上，培育抗性林木品种已成为林木育种的新举措，能够显著加速获得具有目标抗性新品种的进程。利用现代生物技术，探究松树对松材线虫的防御机制，有助于松树抗性品种的选育，对实现松材线虫病的持久有效控制具有重要科学意义。
一般而言，植物体在遭受病害侵染后转录水平的基因表达变化明显，这些变化最终决定植株对病害的防御能力。Xu等[2]利用抑制消减杂交技术构建了该病侵染下的马尾松差异表达基因文库，结果显示参与信号转导、转录、翻译、次生代谢等过程的124个基因发生差异表达，这些基因在被侵染24和72 h的马尾松中表达增强，另外还有一类胁迫响应的基因在侵染72 h时表达也增强。但不同抗性品系的马尾松对松材线虫侵染的分子响应程度也有所不同，Zheng等[3]比较了松材线虫侵染下的强、弱抗性马尾松的一些抗逆相关蛋白表达情况，发现抗性品种中的Cu-Zn超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫转移酶以及抗坏血酸过氧化物酶，以及与光合作用相关的ATP合成酶等的表达明显高于敏感品种，并认为这些差异是提高马尾松抗病能力的主要原因。Xie等[4]利用高通量测序技术比较了松材线虫侵染前后的马尾松针叶中的miRNAs的表达变化模式，结果发现松材线虫侵染影响了马尾松中参与植物激素信号转导和RNA转运相关的miRNA及其靶基因的表达，导致受侵染的马尾松针叶中的玉米素和吲哚乙酸等两种植物激素的含量显著降低，阻碍马尾松的生长发育。由此可见，松材线虫侵染下的马尾松中的不同功能的基因的表达均受到明显的影响，深入探讨松材线虫侵染后马尾松中功能基因的动态表达过程，能够为阐明功能基因表达水平与马尾松抗病能力的关系提供基础。
据此，本研究采用荧光定量PCR(qPCR)技术比较了松材线虫侵染后的马尾松中与病原识别、抗病防御、次生代谢、解毒及生长发育相关功能基因的动态表达，明确具有调控马尾松抗松材线虫病能力的重要功能基因。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
供试马尾松幼苗由福建林业科学院提供，2012年11月种植于福建农林大学森林保护研究所温室中。供试松材线虫于2013年从福建各县市收集的马尾松疫木中分离，通过致病力检测获得具有较强致病力的松材线虫，于拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis sp.)菌落上纯培养，保存于4℃冰箱中备用。
1.2 试验方法
1.2.1 松材线虫悬浊液的制备
将拟盘多毛孢菌接种于PDA平板上，于28℃培养箱中培养5 d。待菌落长好后将松材线虫接种于该菌落中，30℃培养直至菌落完全被松材线虫取食完，进一步用贝尔曼漏斗法分离松材线虫，24 h后收集于10 mL离心管中，3 000 r·min-1离心5 min，去除上清液。将各离心管中的松材线虫汇集并混匀，配制成松材线虫悬浊液。随机吸取1 μL松材线虫悬浊液于显微镜下观察数数，重复50次，计算每微升的松材线虫数量，最终制备成每微升含有20条松材线虫的悬浊液。
1.2.2 松材线虫接种马尾松
取株高为40 cm左右，生长状况一致的马尾松幼苗用于接种松材线虫。采用皮接法，在距离马尾松基部10 cm的主茎的一侧用无菌的刀片斜切1个长度约1 cm的伤口，伤口深至木质部，继而在伤口内固定一个经灭菌处理的脱脂棉球，用封口膜将棉球固定形成斜漏斗状，并往棉球中注入100 μL的上述松材线虫悬浊液，使得每株松材线虫接种的松材线虫的数量为2 000条，期间保湿24 h以保证松材线虫侵染成功，并以接种100 μL无菌水的马尾松作为对照，处理组与对照组均放置于30℃温室中培养。在接种后1、2、3 d，分别取处理和对照组马尾松接种伤口以上5 cm处的茎干，液氮速冻，用于总RNA的提取。每个处理时间及其对照均设3个重复。
1.2.3 不同松材线虫虫量接种马尾松
取上述健康马尾松苗，每株分别接种500、1 000、2 500、5 000、10 000、20 000条松材线虫，以接种无菌水作为对照，在接种后2 d分别取处理与对照样本接种伤口以上5 cm处的茎干，液氮速冻，用于总RNA的提取。处理及对照均设3个重复。
1.2.4 总RNA提取及逆转录
采用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒分别提取处理与对照马尾松茎干组织中的总RNA。进一步采用TIANscript RT Kit (cDNA第一链合成试剂盒)对总RNA进行逆转录，合成单链cDNA。
1.2.5 PCR检测基因的动态表达
qPCR试剂采用北京全式金生物技术有限公司的EasyScript One-step RT-PCR SuperMix，并在ABI荧光定量PCR仪器上完成。本研究分别检测了CC-NBS-LRR抗性蛋白(CC-NBS-LRR resistance-like protein)、胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant-like protein)、生长素响应蛋白家族(auxin-responsive family protein)、休眠/生长素相关蛋白(dormancy/auxin associated-like protein)、黄酮-3-羟化酶(flavonoid 3-hydroxylase)、4-二氢黄酮还原酶(dihydroflavonol-4-reductase)、细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase CYP736B)、细胞色素P450单加氧酶家族(cytochrome P450 mono-oxygenase superfamily)、细胞色素P450(cytochrome P450)、几丁质酶(class Ⅳ chitinase, class Ⅶ chitinase)的基因在松材线虫侵染不同天数下马尾松中较对照马尾松的表达变化情况，以马尾松的肌动蛋白(Actin)为内参基因，相对表达变化量采用2-ΔΔct法进行相对表达量计算[5]，并将对照马尾松样本中的基因的表达量均归一化为1。
表 1 待测基因及其荧光定量PCR引物序列Table 1. The candidate genes and their primers sequence using for qPCR待测基因 上游引物序列 下游引物序列 dihydroflavonol-4-reductase 5′-GCGATGCCGCTATTGT-3′ 5′-TGAGGGCTTGCGAGAA-3′ CC-NBS-LRR resistance-like protein 5′-CCATAAGGATGTGAGAGCCA-3′ 5′-AAAGGTAGAAGTGCGAGAGG-3′ late embryogenesis abundant-like protein 5′-TGCCAAGTGGGACGATG-3′ 5′-TGGACGGTGACGCTGTTT-3′ class Ⅶ chitinase 5′-AGTTGAACCCTGCTCTGC-3′ 5′-GTGGAAACACCGACGAAG-3′ flavonoid 3-hydroxylase 5′-CAACGGCGTGAATGCTAAG-3′ 5′-AGAAGGAAGGCGTGGAGT-3′ class Ⅳ chitinase 5′-CGAGGGCAAGGGATTCTA-3′ 5′-ATTCCTGGCTGTTGATGGC-3′ auxin-responsive family protein 5′-ACGCTGCTGCTGTTCTCC-3′ 5′-CCAGGCTGTGGCATCTTC-3′ dormancy/auxin associated-like protein 5′-TTCAGGTCCCTTCTTTGC-3′ 5′-CTTTCGGTTTGTTTGCC-3′ cytochrome P450 mono-oxygenase superfamily 5′-AATCCGTCGTAGGCAACA-3′ 5′-GCCCGCCACATAGAAAT-3′ cytochrome P450 5′-GTCGGAAACCTCCACCAAC-3′ 5′-TAGGGACTGAGCCCAAGC-3′ cytochrome P450 monooxygenase CYP736B 5′-GTGGTCTTTGCTCCGTTAGGG-3′ 5′-AGCGTTGGCGTCATTCTGC-3′ actin 5′-CCTTGGCAATCCACATC-3′ 5′-TCACCACTACGGCAGAAC-3′ 2. 结果与分析
2.1 松材线虫侵染不同天数下的马尾松及其对照样本的茎干总RNA
提取了松材线虫侵染不同天数下的马尾松及其对照样本的茎干总RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测各样本中提取的总RNA完整性好(图 1)，能够用于逆转录合成cDNA。
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图 1 松材线虫侵染不同天数下的马尾松较其对照样本的茎干总RNA注：泳道1~3为受侵染马尾松茎干样本的总RNA；泳道4~6为对照马尾松茎干样本的总RNA。Figure 1. Total RNA from the stems of P. massoniana after different days of B. xylophilus infestation and the corresponding control groups2.2 松材线虫侵染不同天数下马尾松中病原识别与抗逆调节基因的表达变化
利用qPCR检测了松材线虫侵染1、2、3 d的马尾松茎干较相同天数下的对照样本中的类CC-NBS-LRR抗性蛋白基因以及类晚期胚胎发育丰富蛋白基因的表达变化，结果显示，CC-NBS-LRR抗性蛋白基因在受松材线虫侵染的样本中的表达较对照样本上调，且随着侵染天数的增加，该基因的上调表达倍数增大。与之相对，类晚期胚胎发育丰富蛋白基因在侵染1、2、3 d的处理样本中较对照样本呈先下调后上调再下调的变化趋势，并在侵染第2 d的处理样本中较对照样本明显上调(图 2)。此外，几丁质酶(chitinase)作为植物主要的病程相关蛋白之一，本研究也发现，与对照组相比，class Ⅶ chitinase基因在受侵染的马尾松样本中也呈现先低后高再低的表达变化，并在侵染2 d的处理样本中的表达丰度最高，class Ⅳ chitinase基因则在侵染不同天数下的处理样本中的表达水平均高于对照样本，其中也以侵染2 d的处理样本中的基因表达水平最高，该结果预示了马尾松响应松材线虫侵染的基因表达的时间响应模式。
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图 2 松材线虫侵染不同天数下的马尾松较其对照样本中的病原识别和抗逆调节基因的表达差异注：A为CC-NBS-LRR抗性蛋白基因；B为late embryogenesis基因；C为class Ⅶ chitinase基因；D为class Ⅵ chitinase基因。Figure 2. The differentially expressed genes relative to pathogen recognition and resistance regulation from the stems of P. massoniana infected by B. xylophilus in comparison with the corresponding control groups2.3 松材线虫侵染不同天数下马尾松中植保素合成基因的表达变化
进一步比较了与植保素合成相关的黄酮-3-羟化酶(flavonoid 3-hydroxylase, FH)及4-二氢黄酮还原酶(dihydroflavonol-4-reductase, DFR)基因在受侵染的处理样本较对照样本中的表达差异，结果也显示，这2个基因在受侵染1 d的处理样本中较对照样本下调表达，侵染2 d时，处理样本中的这连个基因的表达明显上调，随后这2个基因的表达水平降低，其中4-二氢黄酮还原酶基因在受侵染3 d的处理样本中的表达对照样本(图 3)，不利于黄酮类植保素的合成。
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图 3 松材线虫侵染不同天数下的马尾松较其对照样本中的植保素合成相关基因的表达差异注：A为flavonoid 3-hydroxylase基因；B为dihydroflavonol-4-reductase基因。Figure 3. The differentially expressed genes involved phytoalexin synthesis from the stems of P. massoniana infected by B. xylophilus in comparison with the corresponding control groups2.4 松材线虫侵染不同天数下马尾松中细胞色素P450基因的表达变化
植物中的细胞色素P450家族基因参与了有毒物质的解毒以及次生物质代谢过程，本研究检测了松材线虫侵染后的马尾松中3个细胞色素P450(cytochrome P450, CYP)及其单加氧酶(cytochrome P450 mono-oxygenase)基因的表达变化，结果显示，与对照样本相对，3个细胞色素P450相关基因的表达均呈现先低后高再降低的表达变化趋势，其中在侵染第2 d的处理样本中较对照样本上调表达(图 4)。
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图 4 松材线虫侵染不同天数下的马尾松较其对照样本中的细胞色素P450基因的表达差异注：A为cytochrome P450基因；B为cytochrome P450 mono-oxygenase superfamily基因；C为cytochrome P450 mono-oxygenase CYP7368基因。Figure 4. The differentially expressed cytochrome P450 relevant genes from the stems of P. massoniana infected by B. xylophilus in comparison with the corresponding control groups2.5 松材线虫侵染不同天数下马尾松中生长素相关基因的表达变化
松材线虫侵染影响了马尾松的生长发育，本研究还检测了松材线虫侵染后的马尾松中的生长素响应蛋白家族(auxin-responsive family protein)基因及休眠生长素相关蛋白(dormancy/auxin associated-like protein)基因的表达变化，结果表明这2个基因在松材线虫侵染2 d的处理样本中表达较对照样本明显上调，而在侵染1、3 d内的处理样本中的表达水平与对照样本相近，或略低于对照样本(图 5)，由此可见松材线虫侵染使得马尾松中的生长素相关基因表达在短时间明显提高，但随后又迅速降低，可能影响生长素行使功能。
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图 5 松材线虫侵染不同天数下的马尾松较其对照样本中的生长素响应基因的表达差异注：A为auxin-responsive family protein基因；B为dormancy/auxin associated-like protein基因。Figure 5. The differentially expressed genes involved in auxin-response from the stems of P. massoniana infected by B. xylophilus in comparison with the corresponding control groups2.6 不同虫量侵染下的马尾松中的FH及CYP基因表达变化
为进一步研究接种松材线虫的数量对马尾松中基因表达量影响，分别检测了接种500、1 000、2 500、5 000、10 000、20 000条线虫的马尾松较未接种线虫的对照样本中FH及CYP基因的表达变化，结果显示，对于FH基因，在接种虫量分别为500、1 000、2 500条的处理样本中的表达量高于对照样本，当接种虫量为5 000条以上时，FH基因在处理样本中的表达低于对照样本。对于CYP基因，当接种虫量为500条和1 000条时，其在处理样本中的表达量高于对照样本，当接种虫量在2 500条以上时，处理样本中CYP基因表达水平较对照样本低，且随接种虫量的加大，CYP的基因下调表达倍数不断增大(图 6)。可见，当接种的松材线虫的数量超过一定的阈值后，马尾松中的基因表达随侵染松材线虫数量的增加而不断降低。
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图 6 不同数量松材线虫侵染下的马尾松茎中的FH和CYP基因表达变化注：A为FH基因；B为CYP基因。Figure 6. Changes in the genes expression from the stems of P. massoniana after different quantities of B. xylophilus infestation3. 讨论与结论
研究不同环境条件下，生物体中功能基因的动态表达过程是揭示其生物学响应机制的重要过程，明确该过程对于了解生物体应对环境变化的适应调节机制具有十分重要的意义。松材线虫侵染往往导致松树的最终枯萎死亡，而该过程涉及信号转导、抗逆防御、代谢等相关基因的表达变化行为[3, 6-7]。本研究利用qPCR检测了松材线虫侵染下的马尾松中的病原识别、次生物质合成、抗逆调节、解毒及生长发育相关基因的动态表达情况，结果发现松材线虫侵染致使马尾松茎干中的这些基因表达发生改变，并以侵染2 d尾松中的表达变化最明显。
深入分析认为，松材线虫的侵染首先影响了马尾松中识别病菌侵害的元件——CC-NBS-LRR resistance protein基因的表达，NBS (nucleotide-binding site)和LRR (leucine-rich repeats)2个结构域是抗病基因编码的大部分蛋白质中包含的2个重要组成部分[8, 9]，其中的NBS包含有高度保守的P-loop, kinase-2和Gly-Leu-Pro-Leu等基序(motifs)，因而具有信号传递的功能[9]；LRR则具有高亲和的结构域，为蛋白与蛋白的互作提供有效位点[10-11]。松材线虫侵染下马尾松茎干中的CC-NBS-LRR resistance protein基因表达随侵染天数的增加而增强，预示着病原侵害信号随时间延长而不断放大。在此影响下，具有抗逆调节作用的晚期胚胎发育丰富蛋白基因(late embryogenesis abundant-like protein, LEA)的表达随侵染时间的延长先增加后下降。该蛋白根据其氨基酸的不同组成可分为7种不同的组分，在拟南芥中过量表达LEA group2可以影响植株中如病程相关蛋白等植物防御相关的蛋白的表达[12]；对于此，作为植物病程相关蛋白之一的几丁质酶[13-14]基因的表达变化行为与LEA相似，佐证了LEA的调控作用，同时也显示了马尾松响应松材线虫侵染下基因的时空表达行为。
除此之外，松材线虫侵染的马尾松中的与黄酮类植保素合成相关的黄酮-3-羟化酶及二氢黄酮醇-4-还原酶基因[15]也呈类似的表达变化趋势，这些基因的表达变化也将影响具有化学防御作用的黄酮类化合物的生物合成，影响植株的抗病能力；与之相对，具有解毒毒害作用并参与次生代谢的细胞色素P450基因[16-17]随侵染时间的延长呈下调表达变化趋势，将不利于受侵染的马尾松对有毒物质的分解作用。在此影响下，受侵染的马尾松中的生长素响应家族蛋白基因以及休眠/生长素相关蛋白基因的表达也随之改变，此变化将对生长素的生长调控作用产生影响。Xie等[4]研究发现松材线虫侵染影响了与调控植物激素信号转导途径的相关miRNA的表达，受侵染样本中的生长素含量也显著低于对照样本，不利于植株的生长发育。
此外，本研究还发现当对受侵害的马尾松中的基因表达随接种线虫虫量较少时，黄酮-3-羟化酶与细胞素P450基因的表达随着接种虫量的增加而增大，然而，当接种虫量大于某一阈值(5 000条)时，这些基因在受侵害的样本中表达下调，并随接种虫量的增加，其下调倍数不断加大，预示了马尾松对松材线虫侵染的具有一定的承受能力，当超过此范围后，受侵害的马尾松中功能基因的表达将受到显著的影响。
通过上述结果可见，松材线虫侵染下的马尾松中的基因表达具有时间响应特性，表现为受侵染2 d尾松中的分子响应最为强烈，该时间下的受害马尾松中与病原识别、抗逆调节、次生代谢及生长发育相关的基因的表达丰度变化最为明显，该结果可为林业生产上制定马尾松对松材线虫的防治策略以及寻找能够用于抗病马尾松分子育种的基因资源提供理论支持。
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图 1 松材线虫侵染不同天数下的马尾松较其对照样本的茎干总RNA
注：泳道1~3为受侵染马尾松茎干样本的总RNA；泳道4~6为对照马尾松茎干样本的总RNA。
Figure 1. Total RNA from the stems of P. massoniana after different days of B. xylophilus infestation and the corresponding control groups
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图 2 松材线虫侵染不同天数下的马尾松较其对照样本中的病原识别和抗逆调节基因的表达差异
注：A为CC-NBS-LRR抗性蛋白基因；B为late embryogenesis基因；C为class Ⅶ chitinase基因；D为class Ⅵ chitinase基因。
Figure 2. The differentially expressed genes relative to pathogen recognition and resistance regulation from the stems of P. massoniana infected by B. xylophilus in comparison with the corresponding control groups
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图 3 松材线虫侵染不同天数下的马尾松较其对照样本中的植保素合成相关基因的表达差异
注：A为flavonoid 3-hydroxylase基因；B为dihydroflavonol-4-reductase基因。
Figure 3. The differentially expressed genes involved phytoalexin synthesis from the stems of P. massoniana infected by B. xylophilus in comparison with the corresponding control groups
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图 4 松材线虫侵染不同天数下的马尾松较其对照样本中的细胞色素P450基因的表达差异
注：A为cytochrome P450基因；B为cytochrome P450 mono-oxygenase superfamily基因；C为cytochrome P450 mono-oxygenase CYP7368基因。
Figure 4. The differentially expressed cytochrome P450 relevant genes from the stems of P. massoniana infected by B. xylophilus in comparison with the corresponding control groups
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图 5 松材线虫侵染不同天数下的马尾松较其对照样本中的生长素响应基因的表达差异
注：A为auxin-responsive family protein基因；B为dormancy/auxin associated-like protein基因。
Figure 5. The differentially expressed genes involved in auxin-response from the stems of P. massoniana infected by B. xylophilus in comparison with the corresponding control groups
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图 6 不同数量松材线虫侵染下的马尾松茎中的FH和CYP基因表达变化
注：A为FH基因；B为CYP基因。
Figure 6. Changes in the genes expression from the stems of P. massoniana after different quantities of B. xylophilus infestation
表 1 待测基因及其荧光定量PCR引物序列
Table 1 The candidate genes and their primers sequence using for qPCR
待测基因 上游引物序列 下游引物序列 dihydroflavonol-4-reductase 5′-GCGATGCCGCTATTGT-3′ 5′-TGAGGGCTTGCGAGAA-3′ CC-NBS-LRR resistance-like protein 5′-CCATAAGGATGTGAGAGCCA-3′ 5′-AAAGGTAGAAGTGCGAGAGG-3′ late embryogenesis abundant-like protein 5′-TGCCAAGTGGGACGATG-3′ 5′-TGGACGGTGACGCTGTTT-3′ class Ⅶ chitinase 5′-AGTTGAACCCTGCTCTGC-3′ 5′-GTGGAAACACCGACGAAG-3′ flavonoid 3-hydroxylase 5′-CAACGGCGTGAATGCTAAG-3′ 5′-AGAAGGAAGGCGTGGAGT-3′ class Ⅳ chitinase 5′-CGAGGGCAAGGGATTCTA-3′ 5′-ATTCCTGGCTGTTGATGGC-3′ auxin-responsive family protein 5′-ACGCTGCTGCTGTTCTCC-3′ 5′-CCAGGCTGTGGCATCTTC-3′ dormancy/auxin associated-like protein 5′-TTCAGGTCCCTTCTTTGC-3′ 5′-CTTTCGGTTTGTTTGCC-3′ cytochrome P450 mono-oxygenase superfamily 5′-AATCCGTCGTAGGCAACA-3′ 5′-GCCCGCCACATAGAAAT-3′ cytochrome P450 5′-GTCGGAAACCTCCACCAAC-3′ 5′-TAGGGACTGAGCCCAAGC-3′ cytochrome P450 monooxygenase CYP736B 5′-GTGGTCTTTGCTCCGTTAGGG-3′ 5′-AGCGTTGGCGTCATTCTGC-3′ actin 5′-CCTTGGCAATCCACATC-3′ 5′-TCACCACTACGGCAGAAC-3′ 
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