0.   引言

【研究意义】猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种接触性传染性病，临床表现和猪传染性胃肠炎极其相似，表现为以水样便腹泻、呕吐和脱水为主要表征的肠道疾病。该病可以感染所有日龄阶段的猪，尤其是新生仔猪，一旦发病，其死亡率高达100%^[1]。1971年PED在欧洲首次被报道，随后蔓延到世界许多地区；2010年我国多个省份突然爆发了PED，美国、加拿大和墨西哥也大规模爆发，仅2014年就导致美国近千万头仔猪死亡，占美国所有仔猪的近十分之一^[2]，给全球生猪养殖业带来了巨大的经济损失。PEDV是一种单股、正链RNA病毒，具有冠状结构特征。全基因组约长28 kb，包括5′端帽、5′和3′非翻译区、3′poly-A 尾部以及7个开放阅读框^[3]。ORF2和ORF4~6编码4种结构蛋白，包括S、E、M和N蛋白。其中，S蛋白是PEDV主要的免疫蛋白，在PEDV存活和逃避宿主免疫中起着至关重要的作用，为机体产生中和抗体的主要蛋白，在免疫监测中处于优先地位^[4]。利用S蛋白建立PEDV快速检测方法具有较高的可行性。【前人研究进展】PEDV的检测方法主要包括病毒分离鉴定、中和试验、酶联免疫吸附试验等^[5]。这些方法虽然灵敏性和特异性均较高，但在现实操作中过程繁琐、时间长、仪器价格昂贵、需要专业人员才能操作，而且ELISA试剂盒多为进口，成本高^[6]。重组酶介导核酸等温扩增（RAA）是一种新型检测技术，具有快速、简单、低成本等优点，不需要复杂的热环境，在恒温条件下就能快速检测，相对于其他检测方法，优势显著^[7]。近年来，该方法在病毒、细菌的研究中得到成功应用。Mao等^[8]研究报道，猴痘病毒（monkeypox virus, MPXV）在RAA中对于其他痘病毒，如牛痘病毒（vaccinia virus, VACV）具有特异性和非交叉反应性。Nie等^[9]报道采用乙脑病毒（japanese encephalitis virus, JEV）的RT-RAA方法对母猪流产胎儿和公猪的肿胀睾丸样本进行检测，检出率仅为6.49%。此外，RAA还被应用于人类疾病检测。Zhao等^[10]采用RAA方法对人泌尿生殖系统中的血吸虫进行检测，与尿液显微镜检查具有100%的一致性。【本研究切入点】对于利用PEDV的S蛋白建立RT-RAA检测方法目前尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究根据PEDV S基因的高度保守区，设计多对引物和探针，建立针对PEDV 的S基因荧光RT-RAA检测方法，测定其敏感性、特异性和重复性，并进行临床初步应用，为研究PED的诊断与防控提供技术支撑。

1.   材料与方法

1.1   病毒及临床样品

PEDV以及猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV）、猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）、伪狂犬病病毒（porcine pseudorabies virus, PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、猪轮状病毒（porcine rotavirus, PoRV）等猪源病毒由福建省农业科学院畜牧兽医研究所收集保存；40份疑似PEDV感染临床样品为2020–2024年采自福建省19个家庭农场（表1）。

表  1  疑似猪流行性腹泻病料收集的来源信息

Table  1.  Information source and collection of suspected porcine epidemic diarrhea specimens

地区 Region	样本数（份）/来源猪场（个） Samples/Farms
宁德 Ningde	5/2
三明 Sanming	6/2
龙岩 Longyan	10/6
漳州 Zhangzhou	8/3
莆田 Putian	11/6
合计 Total	40/19

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1.2   主要试剂

pMD19-T购自TaKaRa公司；Trelief5α感受态细胞购自擎科公司；引物和探针均由亚尚生物工程有限公司合成；RT-RAA核酸扩增试剂盒（荧光型）购自杭州众测生物科技有限公司；高保真聚合酶购自诺唯赞生物公司；质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自艾科瑞公司。

1.3   引物及探针的设计与筛选

从GenBank基因数据库中下载25株PEDV的S基因序列，通过DNAMAN生物信息学软件分析PEDV的S基因的高度保守区域（图1），利用Primer 5.0软件对PEDV的S基因设计多对引物、探针。引物、探针信息见表2。

图  1  引物及探针所在S基因保守区域

Figure  1.  Conserved region of S gene in which primers and probes are located

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表  2  引物和探针

Table  2.  Primers and probes

名称 Name	序列（5′-3′） Sequence
PEDV S-DF	AAATCTGGCAGTATTGGCTAC
PEDV S-DR	ATCGGCTGAAAGAATGTCC
PEDV S-F1	TATTCCCACCAACTTTAGTATGAGTATTAG
PEDV S-F2	GTATTCCCACCAACTTTAGTATGAGTATTA
PEDV S-F3	AGTATTCCCACCAACTTTAGTATGAGTATT
PEDV S-R1	TAATGCTGACTCTATGGTCTTACATGCTGC
PEDV S-R2	GTTGTAATGCTGACTCTATGGTCTTACATG
PEDV S-R3	TGTAATGCTGACTCTATGGTCTTACATGCT
PEDV S-P	GACAGAATATTTACAGCTTTACAACACGCC(i6FAMdT)(THF)(iBHQ1dT)TAGTGTTGATTGTGC-C3spacer

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1.4   核酸的提取

按照核酸提试剂盒说明书， 提取PEDV、TGEV、CSFV、PRV、PCV、PRRSV、PoRV核酸，并保存于–80 ℃备用。

1.5   重组质粒标准品的构建

根据PEDV S基因序列设计引物（PEDV-DF/DR），以逆转录cDNA为模板进行PCR扩增，预期扩增产物大小为969 bp。将胶回收的产物与pMD19-T载体连接，经PCR检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序鉴定，重组质粒经测序正确后作为标准质粒。通过分光光度计测定浓度，计算拷贝数。

1.6   RT-RAA反应体系

根据荧光型RT-RAA核酸扩增试剂盒说明书，配置50.0 μL反应体系，包括buffer A缓冲液25.0 μL、引物F（10 μmol·L⁻¹）2.0 μL、引物R（10 μmol·L⁻¹）2.0 μL、探针（10 μmol·L⁻¹）0.6 μL、buffer B缓冲液2.5 μL、样本5.0 μL，最后加ddH₂O至50.0 μL。混匀后10 s低速离心，荧光定量PCR仪测定吸光值。

1.7   引物筛选及反应条件优化

将构建好的标准质粒作为模板，设置不同上、下游引物组合处理，筛选出起峰时间最早、荧光信号最强的最佳引物对；确定最佳引物后，以标准质粒作为模板，在37、39、42 ℃下反应20 min，确定最佳反应温度；采用确定的最佳试验条件，将反应时间设定为17、20、25 min进行RT-RAA反应，确定最佳反应时间。

1.8   特异性试验

通过建立的RT-RAA检测方法对TGEV、CSFV、PRV、PCV、PRRSV、PoRV病毒核酸进行检测，评价方法的特异性。

1.9   重复性试验

以10² 、10³、10⁵拷贝·μL⁻¹的3种标准质粒浓度作为模板进行荧光RT-RAA反应，重复3次，以评估检测方法的重复性。

1.10   灵敏度试验

将标准质粒用无核酸酶水进行10倍倍比稀释，选用10⁰～10⁶标准质粒作为模板进行RT-RAA反应，评价方法的敏感性。

1.11   临床检测

利用本研究所建立的荧光RT-RAA检测方法和Ren等^[11]建立的实时荧光定量PCR检测方法，对2020–2024年采集的40份猪组织样品进行检测，比较两者检测结果。

2.   结果与分析

2.1   重组标准质粒的鉴定

以引物PEDV-DF/DR进行PCR扩增，结果（图2）显示在969 bp左右有目的条带，和预期结果一致。测序结果显示重组标准质粒构建成功，经测定其质量浓度为47.1 ng·μL⁻¹，拷贝数为4.43×10¹⁰。

图  2  PEDV S 基因PCR扩增

M：DL2000 Marker；1～4：PEDV S 基因扩增；5：阴性对照。

Figure  2.  PCR amplification of PEDV S gene

M: DL2000 marker; 1–4: PEDV S gene amplification; 5: negative control.

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2.2   最佳引物对及反应条件优化

通过上、下游引物不同组合，进行实时荧光RT-RAA检测，结果（图3）显示，F3/R3引物对的扩增效果最好。通过比较不同温度条件下的起峰时间、荧光信号，结果（图4）显示，当反应温度为42 ℃时，扩增曲线效果最好。通过比较不同时间下的反应强度，结果（图5）显示，当反应时间为20 min时，扩增曲线效果最好。因此，选择42 ℃下作用20 min为最适反应条件。

图  3  荧光型RT-RAA引物筛选

1：F3/R3；2：F3/R2；3：F1/R1；4：F2/R3；5：F3/R1；6：F1/R2；7：F2/R2；8：F1/R3；9：F2/R1；10：阴性对照。

Figure  3.  Screening primers for fluorescence RT-RAA

1: F3/R3; 2: F3/R2; 3: F1/R1; 4: F2/R3; 5: F3/R1; 6: F1/R2; 7: F2/R2; 8: F1/R3; 9: F2/R1; 10: negative control.

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图  4  荧光型RT-RAA反应温度的筛选

1～3分别为42、39和37 ℃。

Figure  4.  Selection of reaction temperature for fluorescent RT-RAA

1–3: 42, 39, and 37 °C, respectively.

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图  5  荧光型RT-RAA反应时间的筛选

1～3分别为反应20、25、17 min。

Figure  5.  Selection of reaction time for fluorescent RT-RAA

1–3: 20, 25, and 17 min reaction time.

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2.3   特异性试验

以PEDV及TGEV、CSFV、PRV、PCV、PRRSV、PoRV的核酸为模板，进行RT-RAA荧光扩增，结果（图6）显示，PEDV产生明显荧光信号，判定为阳性，而其他均无扩增曲线，判为阴性，表明该方法具有很好的特异性。

图  6  荧光型RT-RAA特异性试验

1：PEDV-S；2～8：TGEV、CSFV、PRV、PCV、PRRSV、PoRV、阴性对照。

Figure  6.  Specificity of fluorescent RT-RAA

1: PEDV-S; 2–8: TGEV, CSFV, PRV, PCV, PRRSV, PoRV, and negative control, respectively.

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2.4   重复性试验

以10²、10³和10⁵拷贝·μL⁻¹的标准质粒为模板。通过建立的荧光RT-RAA进行的重复性试验，结果（图7）显示，相同浓度标准质粒的差异很小，说明本试验所建立的荧光RT-RAA具有良好的重复性。

图  7  荧光型RT-RAA的重复性检测

1～3：1×10⁵拷贝·μL⁻¹；4～6：1×10³拷贝·μL⁻¹；7～9：1×10²拷贝·μL⁻¹。

Figure  7.  Repeatability of fluorescent RT-RAA

1–3: 1×10⁵ copies·μL⁻¹; 4–6: 1×10³ copies·μL⁻¹; 7–9: 1×10² copies·μL⁻¹.

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2.5   灵敏度试验

将标准质粒进行10倍倍比稀释，以10⁰～10⁶为模板进行RT-RAA 扩增，结果（图8）显示，随着标准质粒拷贝数的降低，出峰时间逐渐延长，荧光强度逐渐减弱，最低检出拷贝数为10²拷贝数，与常规RT-PCR^[12]相比较，PEDV荧光RT-RAA检测方法的最低检出拷贝数是常规RT-PCR检测方法的1000倍。表明该RT-RAA检测方法具有较高的灵敏度。

图  8  荧光型RT-RAA敏感性试验

1～7：标准质粒依次为10⁶～10⁰ 拷贝·μL⁻¹；8：阴性对照。

Figure  8.  Sensitivity of fluorescence RT-RAA

1–7: standard plasmid at 10⁶–10⁰ copies·μL⁻¹; 8: negative control.

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2.6   临床样品检测

利用本试验所建立的PEDV RT-RAA检测方法对40份临床样本进行检测，结果（表3）显示，3份样品为阳性，阳性率7.5%，与RT-qPCR方法结果相同，说明本试验建立的荧光RT-RAA检测方法，适用于对PEDV的临床检测。

表  3  临床样本的检测

Table  3.  Detection on clinical samples

方法 Method	阳性样品 Number of positives/份	阴性样品 Number of negatives/份	总数 Total/份	阳性率 Positivity rate/%
RT-RAA	3	37	40	7.5
RT-qPCR	3	37	40	7.5

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3.   讨论与结论

PED具有很强的传染性，在全球许多地区的感染率和死亡率均较高，给生猪养殖业造成重大经济损失^[13]。目前，虽然有许多上市的PED疫苗，包括灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗等，但PEDV在长期的流行期间，会适应不同的地区环境^[14]。PEDV研究的最新进展指出，目前尚无特有效的疫苗来防控该病^[15]，PEDV仍然对养猪业的健康造成严重威胁。

近年来，许多学者建立了多种PEDV检测方法，主要包括RT-PCR、RT-qPCR和LAMP等。俞正玉等^[16]建立的PRDV的RT-PCR检测方法，最低可检测出10³ ng·μL⁻¹的PEDV样品，对华东地区采集的318份样品进行检测，PEDV阳性率为34.3%。Song等^[17]建立了可同时检测包含PEDV在内的4种常见猪病的TaqMan多重荧光定量RT-PCR方法，最低检测下限为10¹拷贝·μL⁻¹。Li等^[18]建立并优化了一种PEDV RT-LAMP检测法，通过加入SYBR Green I荧光染料对PEDV进行检测，在61.9 ℃、59 min或80 ℃、3 min即可完成检测，灵敏度要比传统的RT-PCR高100倍。这些方法特异性和灵敏度虽然较高，但由于其操作繁琐、检测时间长、专业性强、不适合快速临床检测。RT-RAA检测方法是近年来兴起的一种检测方法，能够克服以上检测方法检测时间长、操作繁琐等局限性，并已应用于多种病毒检测，如猪轮状病毒（PoRV）^[19]、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）^[20]、禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）^[21]等。在建立RT-RAA检测方法的过程中，引物和探针的选择与设计十分重要，但目前尚无专门的设计程序。因此，建立RT-RAA检测方法重中之重在于引物、探针的筛选。本研究对多株PEDV S蛋白序列进行比对，选择较为保守的区域设计了3对引物和1个探针，通过自由组合筛选出最佳引物对。此外，在RT-RAA反应体系化中，对反应温度的优化也十分重要，本研究将最佳引物温度逐渐提高至42 ℃后，起峰速度、荧光信号均明显增强，因此选择42 ℃为最佳反应温度，这样大大地提高了检测效率。

综上所述，本研究所建立的PEDV RT-RAA检测方法具有灵敏度强、特异性高和重复性好的特点，极大压缩了检测时间和成本，很适合基层对PEDV的快速检测，具有广泛的应用前景。