蝉花Cordyceps cicadae又称金蝉花、大虫草、蝉茸等，是蝉若虫被蝉拟青霉Paecilomyces cicadae感染后形成的虫生真菌^[1]。蝉花为我国特有的名贵药用真菌，具有清热、解毒、祛风、镇痛和明目等多种功能。已有研究表明，蝉花液体发酵能够产生多糖、甘露醇、麦角甾醇、腺苷和透明质酸等多种活性物质^[2-3]。透明质酸又名玻璃酸(hyaluronic acid, HA)，是一种由β-D-N-乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸相互结合而成的直链酸性高分子黏多糖^[4]。透明质酸具有优良的保水性能和黏弹性，广泛应用于化妆品及医疗行业，市场需求空间大。

蝉花广泛分布于我国南方各省，菌株资源丰富多样。由于受地理因素的影响，不同来源的蝉花菌株产生活性物质的能力存在较大差异^[5]。科学鉴定和区分蝉花的地理株系是系统认识和开发利用蝉花资源的重要基础。目前，未见针对我国不同地域蝉花资源遗传多样性的研究。蝉花产透明质酸的研究也仅限于武立琨等^[4]少量报道。内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)分析和随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)技术操作简单、成本低廉，广泛应用于植物、真菌等物种鉴定及遗传多样性研究^[6-9]。本研究借助这2项技术分别对4株蝉花进行分子水平鉴定，并比较各菌株产透明质酸的能力，为蝉花资源的开发利用提供基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   菌种和试剂

蝉花菌株CC1502和CC1504分别从贵州省铜仁市梵净山和雷山县雷公山采集子实体后分离获得，蝉花菌株CC1601和CC1602均于江苏省句容市磨盘山采集不同地点的子实体后分离获得。所有蝉花菌株接种于PDA斜面培养基上，25℃培养至菌丝长满斜面，并于4℃冰箱中保存。

透明质酸(HA)标准品购于上海瑞永生物科技有限公司；2×Hieff PCR Master Mix (With Dye)为上海翊圣生物科技有限公司产品；琼脂糖购于上海生物工程有限公司；四硼酸钠、浓硫酸、咔唑、氯化十六烷基吡啶等均为国产分析纯试剂。

1.1.2   培养基

PDA培养基：土豆200 g·L^-1、葡萄糖20 g·L^-1、琼脂20 g·L^-1，蛋白胨5 g·L^-1，pH自然。

YPD培养基：酵母浸膏1 g·L^-1，蛋白胨8 g·L^-1，葡萄糖20 g·L^-1，KH₂PO₄ 1 g·L^-1, MgSO₄·7H₂O 0.5 g·L^-1，pH6.5。该培养基为发酵基础培养基。

发酵培养基：碳源20 g·L^-1，氮源10 g·L^-1，KH₂PO₄ 1 g·L^-1, MgSO₄·7H₂O 0.5 g·L^-1，pH6.5。

1.2   试验方法

1.2.1   菌落形态观察

取预先在PDA平板活化培养的蝉花菌丝块(直径0.5 cm)接入PDA平板中央，25℃黑暗条件下培养4 d。观察各菌株的菌落形态及生长差异。

1.2.2   ITS序列克隆与分析

本实验室前期已完成菌株CC1504的ITS片段(GenBank NO.KY924490)克隆和序列测定。本研究中，以PDA平板培养另3个蝉花菌株，收集其菌丝，并以EasyPure Plant Genomic DNA Kit(全式金生物技术公司，北京)提取基因组DNA。以获得的基因组DNA为模板，以ITS1：5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′和ITS4：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′为引物进行真菌内转录间隔区(ITS)DNA片段的扩增^[10]。扩增体系20 μL：H₂O 12.2 μL, 5×buffer 4 μL, dNTP(2.5 mmol·L^-1)1.6 μL, ITS1 (10 μmol·L^-1) 0.4 μL, ITS4 (10 μmol·L^-1) 0.4 μL, Taq DNA聚合酶0.4 μL (0.5 U), 模板1 μL。反应程序：95℃预变性3 min，94℃变性0.5 min，55℃复性0.5 min，72℃延伸1.0 min，25个循环；72℃终延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，取1~2 μL(约20 ng)产物与pEASY-Blunt载体连接，并转化E. coli Top10菌株。筛选阳性克隆，并由铂尚生物技术(上海)有限公司完成序列分析。

获得的ITS序列经GenBank (NCBI)数据库BLAST比对分析，并获取其他真菌来源的同源序列。获得ITS序列经ClustalX 1.83进行列队分析后，借助软件MEGA7.0以邻位法构建菌株的系统进化树^[11]。

1.2.3   RAPD-PCR扩增

以各菌株基因组DNA为模板，分别以随机引物AP-A20(5′-GTT GCG ATC C-3′)、AP-D18(5′-GAG AGC CAA C-3′)、AP-G05(5′-CTG AGA CGG A-3′)、AP-H18(5′-GAA TCG GCC A-3′)和AP-I07(5′-CAG CGA CAA G-3′)进行PCR扩增^[12]。扩增体系为25 μL：H₂O 8.5 μL, 2×mixture 12.5 μL, primer (10 μmol·L^-1) 2.0 μL, 模板DNA 2 μL(约20 ng)。扩增程序：94℃预变性4 min；94℃变性0.5 min，34℃复性0.5 min，72℃延伸1.5 min，共40次循环；72℃延伸5 min。反应结束后取4 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳分析。

参考文献[7]的方法进行RAPD数据分析。分别统计各菌株样品的可重复扩增条带，同一位置上的带属于同一个位点，各样品在同一位点有条带的记为1，无条带的记为0，并将0, 1矩阵输入ntedit应用程序。借助聚类分析软件NTSYSpc 2.1计算菌株间的遗传相似性系数，并以UPGMA聚类方法生成聚类图。

1.2.4   透明质酸标准曲线的建立

精确称取0.16 g透明质酸，溶解于蒸馏水并定容至100 mL，再梯度稀释为0.08、0.16、0.32、0.48和0.64 mg·mL^-1的标准溶液，以硫酸咔唑法进行分光光度检测^[4]，检测波长530 nm。以透明质酸的质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标建立透明质酸标准曲线。

1.2.5   蝉花菌株发酵产透明质酸

挑取蝉花菌种接入装有50 mL YPD培养基的250 mL三角瓶中，25℃下，160 r·min^-1振荡培养3 d，至菌丝长满培养液。取种子液按5%的体积比接入50 mL发酵培养基，于同样条件下培养3 d，比较不同碳源(乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉)、不同氮源(蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵)对蝉花发酵产透明质酸的影响。发酵液10 000 g离心10 min，取上清液，用于透明质酸测定。

2.   结果与分析

2.1   蝉花菌株的菌落形态

4株蝉花在PDA平板上均形成白色圆形菌落，菌丝集中生长，后期有分生孢子形成。菌株CC1504较其他菌株的菌丝更加致密，菌株CC1601和CC1602在培养后期出现“角变”现象(图 1)。

图  1  不同蝉花菌株在PDA平板上的菌落形态

注：A为CC1502，B为CC1504，C为CC1601，D为CC1602。

Figure  1.  Colony morphologies of C. cicadae strains on PDA plates

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2.2   ITS序列分析

克隆获得了蝉花菌株的ITS序列，菌株CC1502 (GenBank NO. KY924490)、CC1601(GenBank NO. KY924490)和CC1602 (GenBank NO. MF460361)的序列及菌株CC1504的ITS序列完全一致，长度均为587 bp。系统进化树分析显示其均与已报道的大蝉草(C. cicadae)亲缘关系最为接近(图 2)。因此，依据ITS序列并不能将4个蝉花菌株区分开来。

图  2  蝉花菌株的ITS序列系统进化树

Figure  2.  Phylogenetic trees of C. cicadae strains based on ITS sequences (neighbor-joining method)

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2.3   RAPD多态性分析

以5条引物分别对4株蝉花进行RAPD扩增，电泳结果显示所有引物均能扩增出不同大小的条带，其分子量在0.1~4.0 kb(图 3)。引物AP-G05和AP-I07能够获得较为丰富扩增条带，但菌株间的获得相同条带较多，差异性并不突出。引物AP-A20、AP-D18和AP-H18获得的菌株间差异性条带明显且重复性较好，后续以这3条引物的扩增条带(共22条)进行RAPD多态性分析。

图  3  蝉花菌株的RAPD分析

注：A~E分别为引物AP-A20、AP-D18、AP-G05、AP-H18和AP-I07的扩增图谱；1~4分别为蝉花菌株CC1502、CC1504、CC1601和CC1602；M为1 kb DNA分子量; NC为无模板对照。

Figure  3.  RAPD analysis on 4 C. cicadae strains

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UPGMA聚类分析结果显示(图 4)，菌株间的遗传相似系数为0.61~0.83，4个菌株具有不同的遗传背景。菌株CC1504与其他菌株的遗传相似系数最小，为0.61；遗传相似系数为0.77时，4个菌株被分为3个RAPD群，即菌株CC1601和CC1602为一群，其他两菌株各为一群；相似系数为0.83时，菌株CC1601和CC1602不能区分。

图  4  4株蝉花基于RAPD分析的UPGMA聚类

Figure  4.  UPGMA dendrograms of 4 C. cicadae strains based on RAPD polymorphisms

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2.4   蝉花菌株产透明质酸的比较

以硫酸咔唑法建立的透明质酸标准曲线公式为：y=0.5954x+0.0348，R²=0.9946，其中y为530 nm下的吸光值，x为透明质酸的质量浓度(mg·mL^-1)。

以YPD培养基对4株蝉花进行液体发酵。经硫酸咔唑法检测，菌株CC1502和CC1504的发酵样品呈现明显的紫红色，而菌株CC1601和CC1602无颜色变化。表明前者能够产生透明质酸，而后者不能产生可检测的透明质酸。

比较不同碳源(以蛋白胨为氮源)对菌株CC1502和CC1504产透明质酸的影响。结果显示，两菌株以葡萄糖为碳源产生的透明质酸水平最高，分别为1.35 mg·mL^-1和2.39 mg·mL^-1；以乳糖或淀粉为唯一碳源，两菌株产透明质酸的水平相当，在0.70~0.79 mg·mL^-1；以蔗糖为碳源，菌株CC1502的透明质酸产量最低，而菌株CC1504的透明质酸产量为1.34 mg·mL^-1(图 5)。

图  5  不同碳源对蝉花发酵产透明质酸的影响

Figure  5.  Effect of carbon sources on hyaluronic acid production by C. cicadae strains

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比较氮源(以葡萄糖为碳源)对两菌株发酵产透明质酸的影响。从图 6可知，菌株CC1502和CC1504利用蛋白胨获得的透明质酸含量最高，分别为1.51 mg·mL^-1和2.45 mg·mL^-1；以酵母膏为氮源，两菌株的透明质酸产量分别降低至0.84 mg·mL^-1和1.11 mg·mL^-1；以牛肉膏或硫酸铵为氮源，透明质酸的产量进一步降低。结果表明蛋白胨是两株蝉花产透明质酸的最佳氮源。综合比较，可知菌株CC1504产透明质酸的水平较菌株CC1502高。

图  6  不同氮源对蝉花发酵产透明质酸的影响

Figure  6.  Effect of nitrogen sources on hyaluronic acid production by C. cicadae strains

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3.   讨论与结论

蝉花资源丰富多样，不同来源的蝉花菌株在系统进化及生理活性物质产生上均可能存在差异。本文对源自贵州和江苏的4个蝉花菌株进行DNA水平的遗传多样分析。ITS序列在真菌物种内具有保守型，常用于真菌资源的分类鉴定^[13]。经过ITS序列分析，发现这4株蝉花的ITS序列完全相同。进一步通过RAPD技术分析了这些菌株的遗传差异。发现引物AP-A20、AP-D18和AP-H18能够扩增获得4个蝉花菌株差异性扩增图谱。聚类分析显示，来自句容磨盘山地区的2个蝉花菌株CC1601和CC1602亲缘关系最为接近，但也存在一定的遗传差异。来自贵州的菌株CC1502和CC1504处于不同的遗传分支，而菌株CC1504与其他菌株的亲缘关系最远。蝉拟青霉丰富多样的寄主类型以及气候条件等地理因素影响，使得蝉花资源具有丰富的遗传多样性^[13-14]。

透明质酸等多糖物质是蝉花真菌的重要活性成分，引起了国内外研究人员的关注^[15-17]。武立琨^[4]系统研究了培养基组成、转速和发酵温度等对透明质酸产量的影响，优化了蝉拟青霉产透明质酸的发酵条件。黄锴等^[17]对蝉拟青霉透明质酸提取纯化的工艺进行了研究。本研究发现不同的蝉花菌株发酵产透明质酸的差异明显。贵州地区的两株蝉花均能够产生透明质酸，而江苏句容地区的两株蝉花均不能产生透明质酸。菌株CC1504产透明质酸的能力最强，产量可达2.45 mg·mL^-1。葡萄糖和蛋白胨分别为菌株CC1502和CC1504产透明质酸的最适碳源和氮源。武立琨^[4]研究显示蝉花产透明质酸的最佳碳源为乳糖，而最佳氮源为酵母膏和牛肉膏的混合物。可以得出，蝉花发酵合成透明质酸的营养条件存在菌株上的差异。

本研究利用ITS序列分析结合RAPD技术对蝉花菌株进行了区分鉴定，为后续系统开展蝉花的资源多样性研究奠定了基础。发现两株贵州来源的蝉花菌株均能够产生透明质酸，而利用蝉花发酵制备透明质酸具有生物安全性高的特点，显示出良好的工业应用潜力。同时，蝉花在传代培养过程中容易出现菌株退化^[18]，并降低相关活性物质的合成能力。因此，后期需要从分子水平上揭示蝉花透明质酸的合成机理，以促进该资源的高效利用。