A Vasicinol-producing Bacillus-like Bacterium
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摘要: 采用液相-四级杆飞行时间质谱的方法结合Metlin数据库检索分析14株芽胞杆菌菌株发酵液的胞外成分。筛选出一株产鸭嘴花酚碱的芽胞杆菌菌株为甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus FJAT-16022，其中该成分含量占其发酵液总代谢物含量的1.39%，匹配得分为95.1。表明甲基营养型芽胞杆菌芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus FJAT-16022为鸭嘴花酚碱高产菌株，该研究为芽胞杆菌来源鸭嘴花酚碱活性物质的开发与利用提供理论依据。
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关键词:
- 液相色谱/四极杆飞行时间质谱 /
- 甲基营养型芽胞杆菌 /
- 鸭嘴花酚碱
Abstract: A vasicinol-producing strain of Bacillus methylotrophicus FJAT-16022 was screened from 14 Bacillus-like bacteria with an aid of liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (LC-QTOF MS) combined with retrieval comparison against the mass spectrometry database, Metlin. The obtained vasicinol had a matching score of 95.1 with the database, and its relative content was up to 1.73% of the total metabolites in the cultural supernatants. It appeared that B. methylotrophicus FJAT-16022 was a high-yield strain in producing vasicinol. The result obtained paved the way for the development and utilization of vasicinol from the identified bacterium. -
鸭嘴花酚碱，是一种吡咯并[2, 1-b]喹唑啉类生物碱[1]。英文名称：Vasicinol；Vasicil；(+)-6-Hydroxypeganine；6-Hydroxypeganine；6-Hydroxyvasicine。CAS 5081-51-6，分子式C11H12N2O2，分子量204.2。
关于鸭嘴花酚碱的研究，主要集中在其生物活性上。鸭嘴花酚碱具有抗菌性，如吉利蒙念珠菌、热带念珠菌、红色毛癣菌、青霉菌等[2]真菌；大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、产气肠杆菌、分支杆菌等细菌[3]。Khursheed等[4]研究表明鸭嘴花是因为其含有鸭嘴花酚碱、鸭嘴花碱等成分而具有治疗感冒、咳嗽、百日咳、慢性支气管炎、哮喘等药理作用；Mckillop等[5]指出鸭嘴花因具有鸭嘴花酚碱、鸭嘴花碱等重要衍生物而在印度民间具有一定的医学地位；Liu等[6]研究鸭嘴花可抑制胆碱酯酶，用于开发治疗阿尔茨海默氏病时，在鼠的尿中发现鸭嘴花酚碱和鸭嘴花碱等六个关键代谢物；Nunes等[2]研究发现鸭嘴花酚碱具有抗菌活性；Gao等[7]研究表明鸭嘴花酚碱可以抑制葡萄糖苷酶用于治疗糖尿病；Soni等[8]研究表明鸭嘴花酚碱可以作为祛痰剂。
本研究利用液相四级杆飞行时间质谱 (LC-QTOF-MS) 从14株芽胞杆菌菌株中筛选产鸭嘴花酚碱成分的菌株，建立从大量菌株中快速筛选产鸭嘴花酚碱的方法，确定了检测方法，首次从甲基营养型芽胞杆菌的发酵液中发现了鸭嘴花酚碱，为进一步探索芽胞杆菌产鸭嘴花酚碱的研究和利用提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试菌株：14株芽胞杆菌菌株由福建省农业科学院农业生物资源研究所提供 (表 1)。
表 1 供试芽胞杆菌菌株Table 1. Bacillus strains undergone screening and testing序号 菌株编号 菌株名称 1 FJAT-10012 绳索状芽胞杆菌Bacillus funiculus 2 FJAT-10013 黏琼脂芽胞杆菌Bacillus agaradhaerens 3 FJAT-10022 盐敏芽胞杆菌Bacillus halmapalus 4 FJAT-14248 马氏芽胞杆菌Bacillus macyae 5 FJAT-14249 甲醇芽胞杆菌Bacillus methanolicus 6 FJAT-16022 甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus 7 FJAT-10018 土壤短芽胞杆菌Brevibacillus agri 8 FJAT-10007 软骨素类芽胞杆菌Paenibacillus chondroitinus 9 FJAT-10020 解葡聚糖类芽胞杆菌Paenibacillus glucanolyticus 10 FJAT-10026 沙地绿芽胞杆菌Viridibacillus arenosi 11 FJAT-10028 田地绿芽胞杆菌Viridibacillus arvi 12 FJAT-14266 蜥蜴纤细芽胞杆菌Gracilibacillus dipsosauri 13 FJAT-14255 耐冷嗜冷芽胞杆菌Psychrobacillus psychrotolerans 14 FJAT-2278 副短短芽胞杆菌Brevibacillus parabrevis 培养基：以NA培养基为活化培养基；TSB培养基 (美国BD公司) 为种子培养基和发酵培养。
试剂：色谱纯methanol (乙醇)、色谱纯acetonitrile (乙腈) 均购自美国JT Baker公司，色谱纯ammonium acetate (乙酸铵) 购自上海安谱科学仪器有限公司。
仪器：液相四级杆飞行时间质谱联用仪 (Agilent 1260/6520，美国安捷伦科技公司)；恒温培养振荡器 (智城ZHWY-2102C，上海智城分析仪器有限公司)；pH计 (Sartorius PB-10，德国赛托利斯公司)。
1.2 试验方法
发酵液制备：采用平板划线法活化14株菌株，培养条件为：在TSB培养基中170 r·min-1，30℃培养48 h。
样品制备方法参照文献[9]：将芽胞杆菌发酵液离心分离后，在上清液中加入等体积的-20℃冷甲醇，漩涡震荡混匀后，离心分离取上清液过0.22 μm滤膜，置于4℃冰箱中备用。
色谱质谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Extend C18 (2.1 μm × 50 mm, 1.8 Micron)；柱温：35℃；进样量：2 μL；流动相：A=10 mmol·L-1乙酸铵+水，B=乙腈；流速：0.2 mL·min-1；梯度洗脱程序：0~3 min：B=90%；3~25 min：B=50%；25~35 min：B=90%；MS运行条件：负离子模式；干燥气温度：300℃，干燥气流速：5 L·min-1；雾化器压力：30 psig；毛细管电压：3 500 V；裂解电压：175 V；Skimmer：65.0 V；质量范围：150~1 000 m·z-1。
2. 结果与分析
2.1 产鸭嘴花酚碱芽胞杆菌的筛选
从14个芽胞杆菌菌株发酵液的代谢物中筛选到1株产鸭嘴花酚碱菌株，为甲基营养型芽胞杆菌FJAT-16022，其他菌株暂无检出该成分。甲基营养型芽胞杆菌FJAT-16022的发酵液的总离子流图如图 1所示，分析结果见表 2，鸭嘴花酚碱与谱库检索匹配得分为95.1，相对含量为1.39%。
表 2 产鸭嘴花酚碱芽胞杆菌Table 2. Vasicinol-producingBacillus strains
序号菌株名称 菌株编号 保留时间
/min匹配得分 相对含量
/%精确分子量 质核比 CAS号 1 甲基营养型芽胞杆菌 FJAT-16022 13.6141 95.1 1.39 204.0889 203.0818 5081-51-6 2 绳索状芽胞杆菌 FJAT-10012 - - 0 - - - 3 黏琼脂芽胞杆菌 FJAT-10013 - - 0 - - - 4 盐敏芽胞杆菌 FJAT-10022 - - 0 - - - 5 马氏芽胞杆菌 FJAT-14248 - - 0 - - - 6 甲醇芽胞杆菌 FJAT-14249 - - 0 - - - 7 土壤短芽胞杆菌 FJAT-10018 - - 0 - - - 8 软骨素类芽胞杆菌 FJAT-10007 - - 0 - - - 9 解葡聚糖类芽胞杆菌 FJAT-10020 - - 0 - - - 10 沙地绿芽胞杆菌 FJAT-10026 - - 0 - - - 11 田地绿芽胞杆菌 FJAT-10028 - - 0 - - - 12 蜥蜴纤细芽胞杆菌 FJAT-14266 - - 0 - - - 13 耐冷嗜冷芽胞杆菌 FJAT-14255 - - 0 - - - 14 副短短芽胞杆菌 FJAT-2278 - - 0 - - - 2.2 芽胞杆菌来源鸭嘴花酚碱成分分析
甲基营养型芽胞杆菌FJAT-16022发酵液中的鸭嘴花酚碱的离子提取色谱、质谱图见图 2~4，鸭嘴花酚碱离子响应度为8.9×104(图 2)，同位素峰的相对丰度和同位素峰的间距见同位素峰图 (图 3) 和质谱图 (图 4)。质谱采用负离子模式电离，负离子模式下产生如[M-H]-、[M+X]-等的不同准分子离子 (X为所有溶剂或缓冲剂阴离子)，判断203.082峰位[M-H]-准分子离子峰，测得精确即分子质量为204.089，而实际精确分子质量为204.090(http://www.sisweb.com/referenc/tools/exactmass.htm)，质量偏差为-4.9×10-6。综合分子式结果 (C11H12N2O2)、同位素峰的相对强度及间距和Metlin库中匹配值 (95.1)，基本确定该成分为鸭嘴花酚碱，其分子结构图如图 5所示。
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图 2 甲基营养型芽胞杆菌FJAT-16022鸭嘴花酚碱离子提取色谱Figure 2. Extracted ion chromatogram (EIC) of vasicinol in FJAT-16022![]()
图 3 甲基营养型芽胞杆菌FJAT-16022中鸭嘴花酚碱同位素峰结果Figure 3. Isotopic peak of vasicinol from FJAT-160223. 讨论与结论
鸭嘴花酚碱的分析检测方法常用的有高效液相色谱法[10]、气相色谱法[11]、液相质谱法[12]、超高效液相色谱仪质谱联用[13]、液相色谱多级质谱联用[14]等，而液相-四级杆飞行时间质谱联用仪 (LC-QTOF/MS) 分析周期短、高分辨率、高灵敏度、高质量精度等特点和强大的定性分析能力[15]，本研究采用该方法快速从14个芽胞杆菌属的菌株中筛选到1株产鸭嘴花酚碱的芽胞杆菌菌株，即甲基营养型芽胞杆菌FJAT-16022。
鸭嘴花酚碱主要从药用植物如鸭嘴花Adhatoda vasica[16-17]、金午时花Sida rhombi-folia L.[18]、心叶黄花稔Sida cordifolia[19]等中提取。未见从芽胞杆菌中发现的报道。本研究筛选到1株产鸭嘴花酚碱成分芽胞杆菌菌株，其相对含量为1.39%，匹配得分为95.1，分子量为204.089，与实际精确分子质量204.090相当。本研究为芽胞杆菌来源的鸭嘴花酚碱活性成分的开发和利用提供了理论基础。
甲基营养型芽胞杆菌具有强大的应用价值，如其可产能从多肽链的N端顺序水解并释放氨基酸的氨肽酶[20]、蛋白酶[21]、果聚糖蔗糖酶[22]等，吴燕燕等[23]研究发现其产的抗菌肽具有保鲜效果，吕倩等[24]研究发现甲基营养型芽胞杆菌具有抗真菌活性，李学红[25]研究发现甲基营养型芽胞杆菌可湿性粉剂可以防治黄瓜灰霉病，黄霄等[26]发现甲基营养型芽胞杆菌对粉蕉苗期枯萎病具有防效，黄霄等[27]发现甲基营养型芽胞杆菌对香蕉枯萎病菌具有抑菌活性。
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图 2 甲基营养型芽胞杆菌FJAT-16022鸭嘴花酚碱离子提取色谱
Figure 2. Extracted ion chromatogram (EIC) of vasicinol in FJAT-16022
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图 3 甲基营养型芽胞杆菌FJAT-16022中鸭嘴花酚碱同位素峰结果
Figure 3. Isotopic peak of vasicinol from FJAT-16022
表 1 供试芽胞杆菌菌株
Table 1 Bacillus strains undergone screening and testing
序号 菌株编号 菌株名称 1 FJAT-10012 绳索状芽胞杆菌Bacillus funiculus 2 FJAT-10013 黏琼脂芽胞杆菌Bacillus agaradhaerens 3 FJAT-10022 盐敏芽胞杆菌Bacillus halmapalus 4 FJAT-14248 马氏芽胞杆菌Bacillus macyae 5 FJAT-14249 甲醇芽胞杆菌Bacillus methanolicus 6 FJAT-16022 甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus 7 FJAT-10018 土壤短芽胞杆菌Brevibacillus agri 8 FJAT-10007 软骨素类芽胞杆菌Paenibacillus chondroitinus 9 FJAT-10020 解葡聚糖类芽胞杆菌Paenibacillus glucanolyticus 10 FJAT-10026 沙地绿芽胞杆菌Viridibacillus arenosi 11 FJAT-10028 田地绿芽胞杆菌Viridibacillus arvi 12 FJAT-14266 蜥蜴纤细芽胞杆菌Gracilibacillus dipsosauri 13 FJAT-14255 耐冷嗜冷芽胞杆菌Psychrobacillus psychrotolerans 14 FJAT-2278 副短短芽胞杆菌Brevibacillus parabrevis 
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表 2 产鸭嘴花酚碱芽胞杆菌
Table 2 Vasicinol-producingBacillus strains
序号菌株名称 菌株编号 保留时间
/min匹配得分 相对含量
/%精确分子量 质核比 CAS号 1 甲基营养型芽胞杆菌 FJAT-16022 13.6141 95.1 1.39 204.0889 203.0818 5081-51-6 2 绳索状芽胞杆菌 FJAT-10012 - - 0 - - - 3 黏琼脂芽胞杆菌 FJAT-10013 - - 0 - - - 4 盐敏芽胞杆菌 FJAT-10022 - - 0 - - - 5 马氏芽胞杆菌 FJAT-14248 - - 0 - - - 6 甲醇芽胞杆菌 FJAT-14249 - - 0 - - - 7 土壤短芽胞杆菌 FJAT-10018 - - 0 - - - 8 软骨素类芽胞杆菌 FJAT-10007 - - 0 - - - 9 解葡聚糖类芽胞杆菌 FJAT-10020 - - 0 - - - 10 沙地绿芽胞杆菌 FJAT-10026 - - 0 - - - 11 田地绿芽胞杆菌 FJAT-10028 - - 0 - - - 12 蜥蜴纤细芽胞杆菌 FJAT-14266 - - 0 - - - 13 耐冷嗜冷芽胞杆菌 FJAT-14255 - - 0 - - - 14 副短短芽胞杆菌 FJAT-2278 - - 0 - - -
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期刊类型引用(1)
1. 陈德局, 陈峥, 刘波, 张海峰, 朱育菁. 产N-羟基异戊巴比妥的芽胞杆菌筛选. 福建农业学报. 2017(10): 1140-1144 . 
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