Identification and Categorization of Ganoderma Varieties Cultivated in Southern China
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摘要: 应用菌丝间拮抗反应对17个我国南方部分产区的灵芝栽培品种菌株进行分析，应用ITS-RFLP技术和ITS序列聚类进行分类鉴定，采用亲和试验进行鉴定结果验证。结果表明：收集到的17个栽培菌株可以分为3个聚类群，分别为赤芝Ganoderma lucidum菌株11个，紫芝Ganoderma sinense菌株1个，还有5个灵芝菌株属于无柄灵芝Ganoderma resinaceum；不同产区选用的栽培灵芝菌株不尽相同，收集的鹿角灵芝、松杉灵芝其实为赤芝，而开平灵芝、0057等则是无柄灵芝。本研究有助于纠正菌种使用混乱现象。Abstract: The Ganoderma varieties cultivated in the producing regions in southern China were collected, identified and organized for information on the resources and future breeding needs. Initially, 17 Ganoderma varieties were screened by the mycelial antagonistic reaction among them. Subsequently, they were identified and classified through the uses of ITS -RFLP and ITS sequence clustering analysis. Finally, the verification by a compatibility test was conducted on the strains. The results indicated that they belonged to 3 categories with 11 of them being G. lucidum, one of them G. sinense, and 5 of them G. resinaceum. The strains selected for cultivation varied from region to region. For instance, the Lujiao Lingzhi and Xuezhi were G. lucidum, whereas, Kaiping and "0057" were G. resinaceum.
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Keywords:
- cultivation /
- variety /
- Ganoderma lucidum /
- Ganoderma sinense /
- Ganoderma resinaceum
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灵芝是我国著名的药用真菌，在神农本草经中便记载其具有“补中，增智慧，不忘”等功效[1]。20世纪70年代开始林志彬等[2]在对灵芝药理和临床的研究过程中提出来了灵芝“扶正固本”作用机制的假说，并在长期的研究中证明并完善这一假说。随着灵芝栽培技术的成熟和加工提取技术的进步，越来越多的人得以享受灵芝带来的健康生活。然而在灵芝产量逐年递增的同时，也存在灵芝相关产品质量参差不齐，灵芝栽培品种庞杂混乱以及市售灵芝品种属性不清的问题。
当前在灵芝品种鉴定和分类常用的方法，主要有传统的形态学鉴定，菌丝拮抗反应，酯酶同工酶分析，分子标记技术和ITS序列比对分析等方法[3-7]。本研究从我国南方福建、安徽及广东等省部分灵芝产区地收集灵芝栽培菌株17个，结合菌丝拮抗试验，ITS序列分析以及不同菌株间的亲和反应等技术手段，以期对这些栽培灵芝品种进行鉴定。从市场源头加以鉴别，为规范灵芝市场，选用正确的灵芝品种提供理论依据，同时为灵芝种质资源保护和栽培用种选育提供指导。
1. 材料与方法
1.1 供试菌株
供试菌株(表 1) 收集于福建、安徽及广东部分灵芝产地的栽培灵芝品种，现保藏于福建农林大学菌物研究中心。
表 1 供试菌株Table 1. Varieties of Ganoderma tested编号 原名称 来源 鉴定结果 1 血芝 福建省浦城县 Ganoderma lucidum 2 鹿角灵芝 福建省浦城县 Ganoderma lucidum 3 松杉灵芝 福建省浦城县 Ganoderma lucidum 4 赤芝AL 福建省福州市 Ganoderma lucidum 5 赤芝JC 福建省福州市 Ganoderma lucidum 6 开平灵芝 广东省开平市 Ganoderma resinaceum 7 韩芝一号 福建省浦城县 Ganoderma lucidum 8 韩芝三号 福建省浦城县 Ganoderma lucidum 9 黄山一号 安徽省黄山市 Ganoderma lucidum 10 黄山二号 安徽省黄山市 Ganoderma lucidum 11 古田灵芝 福建省古田县 Ganoderma resinaceum, 12 0057 福建省福清市 Ganoderma resinaceum, 13 黄板粉芝 安徽省黄山市 Ganoderma resinaceum, 14 日芝 安徽省黄山市 Ganoderma lucidum 15 科芝 安徽省黄山市 Ganoderma lucidum 16 山东灵芝 安徽省黄山市 Ganoderma resinaceum, 17 紫芝 福建省浦城县 Ganoderma sinense 1.2 供试培养基
PDA培养基：200 g土豆，1 000 g水煮沸后过滤，2%琼脂条煮沸后加入20 g葡萄糖，搅拌均匀，然后制备试管斜面；液体PDA培养基：20%土豆、1 000 g水煮沸后，过滤，加入2%葡萄糖，搅拌均匀，121℃灭菌30 min后备用。
1.3 子实体形态观察及拮抗反应
对几种不同形态的供试菌株子实体进行比较观察并拍照记录，并将供试菌株相距1 cm左右两两配对接种于同一PDA平板中，然后封口，25℃生化培养箱中培养，当菌丝长满时观察交接处菌丝间拮抗反应。
1.4 ITS序列扩增及酶切
供试菌株ITS扩增及酶切方法参照文献[8]的方法。
1.5 ITS序列聚类分析
ITS片段的克隆与测序：按照pMD 18-T Vector的说明书进行操作。阳性克隆经PCR验证后，委托上海生工进行测序。以云芝(Trametes versicolor) ITS序列作为外类群，并下载相应的赤芝，无柄灵芝及紫芝菌株的ITS序列作为参考。用MEGA5.0软件的Neighbor-joining法进行发育树构建，具体方法参考文献[9]。
1.6 亲和配对
采用原生质体单核化技术获取单核菌株，方法参考文献[10]，将获得的不同菌株的单核菌株进行两两配对，通过观察菌丝交接处是否存在锁状联合，来判定不同菌株间亲和关系。
2. 结果与分析
2.1 部分菌株子实体形态及拮抗反应
由图 1可见，由于栽培模式和栽培品种选择的不同，灵芝子实体表现出不同的形态特征。如在高浓度二氧化碳的栽培环境下就容易获得的鹿角状灵芝子实体，而在岀芝过程中温度波动较大或者干湿交替频繁则容易引起的灵芝子实体表面不平整和颜色深浅不一的现象。同时存在一些灵芝品种其子实体形态上与赤芝或紫芝近似，因此单凭子实体形态进行灵芝的品种鉴定是十分困难的，还需借助于微观形态结构和分子鉴定技术手段。
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图 1 形态各异的灵芝子实体注：A为0057，B为赤芝JC，C为紫芝，D为鹿角灵芝，E为松杉灵芝。Figure 1. Morphologies of Ganoderma fruiting bodies通过拮抗试验可以初步确定菌株间的亲缘关系，如果出现拮抗现象的菌株则可确定为不同菌株，而无拮抗现象则有可能是同一个菌株。17个收集菌株的拮抗统计见表 3，可见大部分菌株间都有明显的拮抗现象，只有少数菌株间没有发生拮抗现象，如开平灵芝和古田灵芝。由此可见不同地区的栽培灵芝菌株存在一定的多样性，这也可以从一定程度上解释了市场上灵芝质量参差不齐的原因。虽然拮抗反应可以较快捷的对菌株间的关系进行一个大概的判定，但由于实验误差和观察者的判定标准存在差异，其在实际应用中存在较大的局限性。
表 2 不同菌株拮抗试验结果Table 2. Antagonistic test result on Ganoderma strains菌株 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 + + + + + + + + + + + + + + + + 2 + + + + + - + - + + + + + + + 3 + + + + - + + + + + + + + + 4 + + + + + + + + + + + + + 5 + + + + + + + + + + + + 6 + + + + - + + + + + + 7 + + + + + + + + + + 8 + + + + + + + + + 9 - + + + + + + + 10 + + + + + + + 11 + + + + + + 12 + + + + + 13 + + + + 14 + + + 15 + + 16 + 注：“+”表示出现菌株间存在拮抗现象，“-”则没有出现拮抗现象。 表 3 不同菌株间亲和配对结果Table 3. Pairing compatibility on Ganoderma strains菌株 紫芝 古田
灵芝0057 赤芝
JC赤芝
AL血芝 松杉
灵芝开平
灵芝紫芝 + - - - - - - - 古田灵芝 + + - - - - + 0057 + - - - - + 赤芝JC + + + + - 赤芝AL + + + - 血芝 + + - 松杉灵芝 + - 开平灵芝 + 注：“+”表示出现菌株可以亲和配对，“-”则不能配对。 2.2 ITS序列扩增及酶切鉴定
由图 2可知，17个栽培菌株的ITS片段大小都在650 bp左右，可见灵芝种间ITS片段大小差异不大。通过DNA限制性内切酶HaeⅢ和MspI对ITS序列进行酶切后，可以将17个栽培菌株分为3类，一类为编号17的紫芝菌株不能被HaeⅢ酶切; 第二类为不能被MspI酶切的菌株；第3类为可以被这2个酶酶切的菌株，这一类菌株与赤芝酶切结果一致应赤芝。第二类菌株则与我们常见的赤芝和紫芝在ITS-RFLP的结果不同，分别为古田灵芝、0057、开平灵芝、黄板粉芝和山东灵芝，因此这一类菌株有可能并非赤芝或紫芝。
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图 2 ITS扩增及HaeⅢ和MspI酶切电泳Figure 2. ITS-PCR and ITS on genes cleaved by DNA restriction enzyme HaeⅢ and MspI2.3 ITS序列聚类分析
通过序列比对发现上述第二类菌株与无柄灵芝Ganoderma resinaceum的ITS序列最为接近，结合子实体特征表明其应属于无柄灵芝。根据MEGA5.0软件中的neighbour-joining methods，对测定的ITS序列进行聚类分析，具体聚类结果见图 3。从图 3可以看到，测定的10个供试菌株可以分为3类，这与ITS-RFLP的结果相同，即紫芝为一类，赤芝为一类，无柄灵芝为一类。其中几个无柄灵芝之间同源相似度高达100%，而赤芝菌株之间存在一定的差异性。由此可见在收集的栽培灵芝菌株中，除了常见的赤芝和紫芝以外，还有一定数量的灵芝属于无柄灵芝。
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图 3 根据ITS序列构建的灵芝菌株进化树Figure 3. Neighbor-joining phylogenetic tree based on ITS sequence2.4 亲和配对结果分析
由表 3可见只有同种间不同菌株的单核菌株才可以亲和配对如赤芝AL和赤芝JC，并形成锁状联合，其中收集的松杉灵芝也可以与其他赤芝亲和配对，因此应该为赤芝的一种，而并非传分类上的松杉灵芝。不同种间不同菌株的单核菌株则不能亲和配对如紫芝和0057或紫芝与赤芝JC等。这一结果与之前ITS-RFLP和聚类分析结果相同，从而进一步确定搜集到的菌株可以分为3类。
3. 讨论与结论
当前我国灵芝产业蓬勃发展，灵芝需求量增长强劲，但也存在着菌种混乱，同种异名或是同名异种现象，造成了灵芝品质参差不齐，商品名称混乱，进而影响灵芝保健产品的质量。由于灵芝子实体形态受生长环境和栽培条件影响很大，通过子实体形态特征有时很难区分不同的灵芝品种[11]。因此随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子生物学技术手段被用于灵芝的品种鉴定与分类当中。如利用AFLP及ITS-RFLP可以快速对灵芝多样性进行评价与分析[12]。基于灵芝β-微管蛋白基因部分序列及ITS序列进行灵芝品种的鉴定也被广泛使用[13-14]。此外采用SRAP、ISSR、RAPD等分子标记技术技术进行种间的区分，亲缘关系的判定也十分普遍[15-17]。同时随着灵芝全基因测序的完成，基于全基因组的SSR标记开发将有助于不同灵芝品种间的分子ID的构建[18-19]。因此采用子实体形态鉴别和分子技术相结合是一种比较好的灵芝品种鉴定的手段。本试验利用拮抗反应对17个栽培灵芝品种进行区分，发现不同地区选用的灵芝品种不尽相同，具有一定的差异性。通过ITS-RFLP技术对17个菌株进行区分，结果表明这些菌株可以分为3类，其中一类通过测序比对发现属于无柄灵芝，如古田灵芝、开平灵芝等，这一类灵芝产孢子粉量大，且与赤芝形态接近，容易被误用为赤芝销售。一些由于生产环境差异导致的子实体形态变异的灵芝如鹿角灵芝，以及松杉灵芝，通过鉴定实为赤芝。同时通过ITS序列聚类分析和单核菌株亲和试验也验证了这一结果，且不同种间灵芝不能亲和配对。
全世界大概有250多个灵芝属的种被描述和鉴定，其中我国境内分布有98个种[20]。除了常见的赤芝和紫芝，而其他灵芝栽培较少，其原因可能有以下几个方面：(1) 品种本身不适于人工栽培，如产量低、抗逆性差、有效成分含量低等；(2) 这些品种的有效成分研究较少，缺乏进一步的药理分析及临床使用作为支撑；(3) 许多灵芝品种未被国家药典收录，也不能作为保健品原料在市场上流通，因此销售市场受到极大的限制。灵芝作为我国传统的中药材使用已经有数千年的历史，因其独特的药用功效沿用至今。这些被广泛使用的灵芝，不仅包含现在常用的赤芝、紫芝及松杉灵芝等，还包括其他品种的灵芝如树舌灵芝、薄树灵芝、无柄灵芝等。如何更好地发掘，利用与保护，需要从品种鉴定到药理活性等多方面，做进一步的研究。
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图 1 形态各异的灵芝子实体
注：A为0057，B为赤芝JC，C为紫芝，D为鹿角灵芝，E为松杉灵芝。
Figure 1. Morphologies of Ganoderma fruiting bodies
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图 2 ITS扩增及HaeⅢ和MspI酶切电泳
Figure 2. ITS-PCR and ITS on genes cleaved by DNA restriction enzyme HaeⅢ and MspI
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图 3 根据ITS序列构建的灵芝菌株进化树
Figure 3. Neighbor-joining phylogenetic tree based on ITS sequence
表 1 供试菌株
Table 1 Varieties of Ganoderma tested
编号 原名称 来源 鉴定结果 1 血芝 福建省浦城县 Ganoderma lucidum 2 鹿角灵芝 福建省浦城县 Ganoderma lucidum 3 松杉灵芝 福建省浦城县 Ganoderma lucidum 4 赤芝AL 福建省福州市 Ganoderma lucidum 5 赤芝JC 福建省福州市 Ganoderma lucidum 6 开平灵芝 广东省开平市 Ganoderma resinaceum 7 韩芝一号 福建省浦城县 Ganoderma lucidum 8 韩芝三号 福建省浦城县 Ganoderma lucidum 9 黄山一号 安徽省黄山市 Ganoderma lucidum 10 黄山二号 安徽省黄山市 Ganoderma lucidum 11 古田灵芝 福建省古田县 Ganoderma resinaceum, 12 0057 福建省福清市 Ganoderma resinaceum, 13 黄板粉芝 安徽省黄山市 Ganoderma resinaceum, 14 日芝 安徽省黄山市 Ganoderma lucidum 15 科芝 安徽省黄山市 Ganoderma lucidum 16 山东灵芝 安徽省黄山市 Ganoderma resinaceum, 17 紫芝 福建省浦城县 Ganoderma sinense 
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表 2 不同菌株拮抗试验结果
Table 2 Antagonistic test result on Ganoderma strains
菌株 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 + + + + + + + + + + + + + + + + 2 + + + + + - + - + + + + + + + 3 + + + + - + + + + + + + + + 4 + + + + + + + + + + + + + 5 + + + + + + + + + + + + 6 + + + + - + + + + + + 7 + + + + + + + + + + 8 + + + + + + + + + 9 - + + + + + + + 10 + + + + + + + 11 + + + + + + 12 + + + + + 13 + + + + 14 + + + 15 + + 16 + 注：“+”表示出现菌株间存在拮抗现象，“-”则没有出现拮抗现象。
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表 3 不同菌株间亲和配对结果
Table 3 Pairing compatibility on Ganoderma strains
菌株 紫芝 古田
灵芝0057 赤芝
JC赤芝
AL血芝 松杉
灵芝开平
灵芝紫芝 + - - - - - - - 古田灵芝 + + - - - - + 0057 + - - - - + 赤芝JC + + + + - 赤芝AL + + + - 血芝 + + - 松杉灵芝 + - 开平灵芝 + 注：“+”表示出现菌株可以亲和配对，“-”则不能配对。
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