Cloning and Polymorphisms of 1st-7th Exons in FSHR of Jinding Ducks
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摘要: 动物的繁殖活动主要受内分泌生殖激素的调控，FSHR存在于卵泡颗粒细胞膜上，属于G蛋白偶联受体家族，对动物卵巢细胞的发育、成熟和排卵具有重要的作用。本研究以高产和低产金定鸭基因组为模板，通过PCR扩增、目的基因片段克隆和测序等方法，获取金定鸭FSHR基因1~7外显子序列，并对基因序列进行比对分析。结果显示，序列a包含第1外显子（185 bp）的完整序列，第1内含子（145 bp）的部分序列；序列b包含第2（75 bp）、3外显子（75 bp）、第2内含子（463 bp）的完整序列，第1（40 bp）、3内含子（47 bp）的部分序列；序列c包含第4外显子（75 bp）的完整序列，第3（180 bp）、4内含子（55 bp）的部分序列；序列d包含第5外显子（78 bp）的完整序列，第4（232 bp）、5内含子（56 bp）的部分序列；序列e包含第6（69 bp）、7外显子（75 bp）、第6内含子（117 bp）的完整序列，第5（133 bp）、7内含子（146 bp）的部分序列。根据基因序列特征，对获取的5段金定鸭FSHR基因序列进行扩增序列测序比对。结果发现：在外显子1第50 bp处存在A/G突变；在外显子2第30 bp处存在A/G突变；在外显子4第33 bp处存在C/T突变；在外显子5第45 bp处存在A/G突变，第19 bp处可能存在A/T突变，33 bp处可能存在C/T突变。金定鸭FSHR基因序列的克隆及SNP突变位点的发现可为后续开展FSHR基因的多态性与金定鸭产蛋性能的相关研究奠定一定的基础。Abstract: Animal reproductive activities are largely regulated by reproductive endocrine hormones. The follicle stimulating hormone receptor (FSHR) is found in the follicular granulose membrane of an ovary cell in a female animal. It is a G protein coupled receptor that plays an important role in the development, maturation and ovulation of the ovary cells. Considering its critical association with poultry broodiness, FSHRs from high-and low-egg-laying Jinding ducks were compared. The fragments at the lengths of 330 bp (Fragment a), 700 bp (Fragment b), 310 bp (Fragment c), 366 bp (Fragment d) and 540 bp (Fragment e) of the genes from the genomic DNAs extracted from the blood samples of the ducks were amplified by PCR. The sequence analysis showed that Fragment a included the entire sequence of the 1st exon (185 bp), as well as a partial sequence of the 1st intron (145 bp) of the gene; Fragment b had the complete sequences of the 2nd intron (463 bp), the 2nd exon (75 bp) and the 3rd exon (75 bp), in addition to the partial sequences of the 1st intron (40 bp) and the 3rd intron (47 bp); Fragment c consisted of the sequence of the 4th exon (75 bp), as well as the partial sequences of the 3rd intron (180 bp) and the 4th intron (55 bp); Fragment d included the sequence of the 5th exon (78 bp), and the partial sequences of the 4th intron (232 bp) and the 5th intron (56 bp); and, Fragment e contained the entire sequences of the 6th exon (69 bp), the 7th exon (75 bp) and the 6th intron (117 bp), also the partial sequences of the 5th intron (133 bp) and the 7th intron (146 bp). By comparison, it was found that the 1st exon had an A/G mutation at position 50 bp; the 2nd exon, an A/G mutation at position 30 bp; the 4th exon, a C/T mutation at position 33 bp; and, the 5th exon, an A/G mutation at position 45 bp, an A/T mutation at 19 bp, as well as a C/T mutation at 33 bp. The results obtained would pave the way for further study on the FSHR polymorphism and egg-laying performance of Jinding ducks.
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Keywords:
- Jinding duck /
- FSHR gene /
- clone /
- polymorphism analysis
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产蛋量属于限制性状和低遗传力性状，是家禽的一个极为重要的数量性状[1]。金定鸭为福建省特色优秀地方蛋鸭品种，具有很强的抗逆、抗盐性，以耐粗饲、产青壳蛋、产大蛋、蛋品质好、耐寒而著称，是我国麻鸭品种产青壳蛋最多的品种。2000年，金定鸭入选国家级畜禽遗传资源保护名录。然而，由于福建省金定鸭品种保护方法比较单一，保护群体较小，缺乏系统选育，影响了保种质量和提纯复壮的速度，导致了种质资源退化。目前闽南一带饲养较多的是群众自繁自养、盲目杂交、未经系统选育的小型金定鸭。该鸭体型、开产、料蛋比与原种金定鸭相比，均有所改善；但由于缺乏系统选育，体型外貌和生产性能参差不齐，有的体型很大、有的很小，有的产蛋量很高、有的又很低，导致其种用价值不高，生产的商品蛋鸭体型外貌严重分离，产蛋性能高低不一，影响其生产潜能的发挥。
动物的繁殖活动主要受内分泌生殖激素的调控，促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)会直接影响卵泡颗粒细胞的增生、卵泡的生长发育以及雌激素的合成与排卵，是影响雌性动物的重要激素[2-3]。促卵泡素受体(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)存在于卵泡颗粒细胞膜上，属于G蛋白偶联受体家族，对动物卵巢细胞的发育、成熟和排卵具有重要的作用[4]。目前对于家禽FSHR基因的研究较少，且大都集中在鸡上，该基因在鸭上的研究相对较少。仅李亨等[5]在高邮鸭中研究发现FSHR基因外显子4上存在多态位点，且该位点与380日龄产蛋数存在显著相关(P < 0.05)，由此说明FSHR基因外显子4的基因型WW对高邮鸭繁殖生理机能有一定的促进作用。
本研究旨在对金定鸭FSHR基因进行克隆和测序，并对其进行生物信息学分析，为从分子标记方面提高金定鸭的产蛋量，培育优质高产的金定鸭新品系，促进金定鸭的规模化饲养与推广提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
于福建省龙海市顺兴金定鸭有限公司饲养试验鸭。在福建省农业科学院畜禽分子遗传育种实验室进行相关的分子试验。
试验选取健康高产金定鸭(≥290枚·年-1)、低产金定鸭(≤210枚·年-1)个体各20只，采用胫静脉采血，EDTA抗凝，然后放入-20℃中保存。总DNA的提取采用基因组DNA试剂盒提取，TE溶解，提取完后放入-20℃保存备用。
1.2 主要试剂
普通琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒均购自TIANGEN公司；Platinum PCR SuperMix, High Fidelity、Nuclease-free water购自福州奥丁生物技术有限公司；pGMT载体、DNA Marker (DL5000)均购自大连TAKARA公司。
1.3 引物的设计与合成
根据在GenBank上已收录的鸭和鸡FSHR基因的DNA序列和mRNA序列，利用Primer 5.0设计相关引物5对，送大连TAKARA公司进行合成，引物序列见表 1。
表 1 用于FSHR基因SNP筛查的引物信息Table 1. Details of 5 primmer pairs for SNP of FSHR gene of Jinding duck引物 引物序列 退火温度
(Tm) /℃片段大小
/bpP1 F: 5′-CAGTCATGTCACGCACAACATT-3′; R: 5′-GTGGCTGCATTTCTGCTCAC-3′ 59; 59 330 P2 F: 5′-GCATTGCTTGAAATATCTTGACT-3′; R: 5′-GCTTAGCACAGGTTAGATGGAA-3′ 56; 57 700 P3 F: 5′-GGGTATGTGGTGAAAGCCTAC-3′; R: 5′-CCCAAAATGCTATCATGAAGCT-3′ 56; 59 310 P4 F: 5′-GAAATGCTTTGCCTTTACCTT-3′; R: 5′-CAACCCATTTCTGAAGAAGGA-3′ 56; 57 366 P5 F: 5′-GTAATGCTGAGCTTCCCTGTTC-3′; R: 5′-GGCTTAATGATGAGAAAAAGGAA-3′ 58; 58 540 1.4 PCR扩增
应用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取产蛋量高(H)、产蛋量低(L)的健康金定鸭血液基因组DNA，分别混合形成2个DNA池，进行PCR扩增反应，PCR反应体系为50 μL：Platinum PCR SuperMix, High Fidelity 45 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA池(第一轮PCR产物稀释10倍)2 μL，ddH2O 1 μL。PCR反应条件：94℃ 2 min，94℃ 30 s，62℃ 30 s，68℃ 30 s，共38个循环; 72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物经1%~2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。用胶回收试剂盒将目的片段回收、纯化后连接到载体pGM-T上，然后转化感受态细胞。
1.5 测序分析
将随机挑选好的5个阳性克隆子送往大连TAKARA公司进行双向测序，测序结果利用DNASTAR软件和NCBI网站的Blast分析程序与鸡的FSHR基因序列进行比对分析。
1.6 FSHR基因相关的SNP筛查
根据所获得的FSHR基因的序列进行SNP筛查。
2. 结果与分析
2.1 PCR扩增结果
分别提取低产和高产金定鸭的基因组DNA，电泳结果显示DNA浓度高(图 1)，适于PCR扩增。图 2为PCR的扩增结果，扩增产物长度分别位于200~500、500~750 bp，扩增片段长度特异性较好，没有非特异性条带，且与预期片段大小一致。PCR产物经回收、克隆，挑取阳性克隆子并进行双向测序，得到长度分别为330、700、310、366、540 bp的片段(图 2)。
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图 1 DNA的电泳结果注：L1~L8为低产金定鸭个体的DNA电泳结果；H1~H9为高产金定鸭个体的电泳结果；M为DL5000。Figure 1. Electrophoresis of DNA products2.2 序列分析
将获得的序列分别与鸡的FSHR进行BLAST比对分析，结果表明序列a包含第1外显子(185 bp)的完整序列，第1内含子(145 bp)的部分序列；序列b包含第2(75 bp)、3外显子(75 bp)、第2内含子(463 bp)的完整序列，第1(40 bp)、3内含子(47 bp)的部分序列；序列c包含第4外显子(75 bp)的完整序列，第3(180 bp)、4内含子(55 bp)的部分序列；序列d包含第5外显子(78 bp)的完整序列，第4(232 bp)、5内含子(56 bp)的部分序列；序列e包含第6(69 bp)、7外显子(75 bp)、第6内含子(117 bp)的完整序列，第5(133 bp)、7内含子(146 bp)的部分序列。
2.3 SNPs分析
金定鸭低产、高产池DNA的PCR扩增产物经回收纯化、双向测序以及拼接处理后，进行比对，结果发现在外显子1第50 bp处存在A/G突变；在外显子2第30 bp处存在A/G突变；在外显子4第33 bp处存在C/T突变；在外显子5第45 bp处存在A/G突变，第19 bp处可能存在A/T突变，33 bp处可能存在C/T突变(图 3、4)。
3. 讨论
FSHR对动物卵巢细胞的发育、成熟和排卵有着重要的调控作用[4]。S.You等[6]首次从鸡卵巢组织中成功克隆出FSHR基因的cDNA序列。到2006年FSHR基因序列的分析和整合结果在鸡上已初步完成[4]。杨孔等[7]研究表明FSHR基因exon4和exon1在罗曼鸡和藏鸡种间存在SNP位点，且该基因的SNP与产蛋量具有显著的相关性。李亨等[8]研究表明文昌鸡FSHR基因外显子的全部区域及中间的内含子区域存在4个SNPs，且文昌鸡exon8区的GG基因型可能为优势基因型，G为优势等位基因，该突变位点可作为研究文昌鸡繁殖性能的相关分子标记。王慧[9]研究表明32周龄鸡卵巢组织FSHR基因的mRNA的差异表达量与产蛋数的杂种优势呈显著正相关，这可能是通过FSHR抑制卵泡闭锁、促进鸡卵泡成熟、刺激颗粒细胞增生、诱导芳香化酶的活性(与E2合成有关)、诱导黄体素受体(LHR)的产生并可诱发排卵等功能的实现。Li Kang等[10]在cFSHR启动子片段检测出单核苷酸替换39个、TTG-CAC的核苷酸替换1个、插入缺失9个共计49个完全突变。康丽等[11]研究表明FSHR基因5′调控区-237，-868位点的突变对新杨褐鸡37周开产日龄和总产蛋数呈显著相关，G+型与产蛋数多有关，其在高产群体中频率较高，G-型可能与开产日龄的早晚有关，这与其在开产日龄较早的地方品种中的频率较高相符，两位点间的作用机理还有待进一步的研究。杨玉等[12]研究表明日粮的能量水平可能影响FSHR基因mRNA的表达以影响卵巢卵泡的发育，进而对鸡的性成熟起到一定的作用；饲料中适当的能量水平可提高FSHR基因mRNA的表达，22周龄的蛋鸡卵巢FSHR基因mRNA的表达量可作为后期蛋鸡产蛋量高低的预示指标。王克华等[13]研究表明，FSHR基因与蛋鸡的蛋重、开产日龄、产蛋数等重要的繁殖性状关系密切，该基因可作为选育优质高产蛋鸡的有效分子标记。因此，本研究选取FSHR基因作为研究金定鸭产蛋性状的候选基因，进行克隆和测序，扩增出金定鸭1~7外显子的全部序列，并找出可能存在的突变位点，为后续发现与金定鸭产蛋性状显著相关的分子标记，培育优质高产的金定鸭新品系奠定基础。结果发现FSHR基因在外显子1第50 bp处存在A/G突变；在外显子2第30 bp处存在A/G突变；在外显子4第33 bp处存在C/T突变；在外显子5第45 bp处存在A/G突变，33 bp处可能存在C/T突变，第19 bp处可能存在A/T突变。
金定鸭FSHR基因第1~7外显子的克隆及1~7外显子上突变位点的发现，可为后续研究FSHR基因的多态性与金定鸭产蛋性能的相关性奠定理论基础。
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图 1 DNA的电泳结果
注：L1~L8为低产金定鸭个体的DNA电泳结果；H1~H9为高产金定鸭个体的电泳结果；M为DL5000。
Figure 1. Electrophoresis of DNA products
表 1 用于FSHR基因SNP筛查的引物信息
Table 1 Details of 5 primmer pairs for SNP of FSHR gene of Jinding duck
引物 引物序列 退火温度
(Tm) /℃片段大小
/bpP1 F: 5′-CAGTCATGTCACGCACAACATT-3′; R: 5′-GTGGCTGCATTTCTGCTCAC-3′ 59; 59 330 P2 F: 5′-GCATTGCTTGAAATATCTTGACT-3′; R: 5′-GCTTAGCACAGGTTAGATGGAA-3′ 56; 57 700 P3 F: 5′-GGGTATGTGGTGAAAGCCTAC-3′; R: 5′-CCCAAAATGCTATCATGAAGCT-3′ 56; 59 310 P4 F: 5′-GAAATGCTTTGCCTTTACCTT-3′; R: 5′-CAACCCATTTCTGAAGAAGGA-3′ 56; 57 366 P5 F: 5′-GTAATGCTGAGCTTCCCTGTTC-3′; R: 5′-GGCTTAATGATGAGAAAAAGGAA-3′ 58; 58 540 
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