Development and Utility of EST-SSR Marker in Capsicum annuum L.
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摘要: 从NCBI数据库下载118 900条辣椒相关EST，对其进行SSR位点搜索，共搜索出3 343条SSR，分布密度为1/17.20 kb，共有287种重复基元。在辣椒EST-SSR中，二核苷酸（1 476个SSR）和六核苷酸（1 128个SSR）占主导地位，所占比例分别为44.15%和33.74%；出现最多的重复基元是GA/TC，占总数的14.30%，其次为CT/AG（94个，占8.11%）。针对3 343条含有SSR的EST设计合成了200对引物。用17份辣椒种质对200对引物进行筛选，196对引物有扩增产物，71对引物表现出多态性，共有220个多态性位点。利用71对多态性引物，对特定亲本P181-2-6和P230-2-5及其杂种一代F1的亲缘关系进行检测，结果说明从辣椒相关EST数据库中开发的SSR引物有较好的可用性。Abstract: A total of 118,900 ESTs in Capsicum annuum L were downloaded from NCBI for identifying and developing an SSR marker. As a result, 3,343 SSRs in the ESTs with an average of one SSR per 17.20 kb were found, including 283 SSR motifs. Analysis on the SSR motifs revealed that they were mostly di-nucleotides (1,476 SSR) and hexa-nucleotides (1,128 SSR), accounting for 44.15% and 33.74% of the total, respectively. GA/TC was the most frequently found motifs (14.30% of all), which was followed by CT/AG (94 SSR, and 8.11% of all). From the 3,343 SSR-containing ESTs, 200 primer pairs were designed and validated for amplification using 17 pepper inbred lines. The results showed that 71 primer pairs yielded 220 amplification bands. Using those 71 pairs of polymorphic primers, the genetic relationship between the parents, P181-2-6 and P230-2-5, and their F1 hybrid was determined. It appeared that the SSR markers identified from the ESTs of C. annuum were potentially of practical applicatios.
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Key words:
- Capsicum annuum L. /
- EST-SSR /
- marker development /
- fingerprinting
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图 1 CF63(上)、CR63(下)对17 份辣椒种质基因组DNA 的扩增结果
注：M为Marker；1~17为辣椒种质。图 2同。
Figure 1. Products amplified by primer PR063,CF63 (top) and CR63 (bottom)
图 2 CF180(上)、CR180(下)对17 份辣椒种质基因组DNA 的扩增结果
Figure 2. Products amplified by primer PR180,CF180 (top) and CR180 (bottom)
图 3 引物CF015、CF043、CFR032、CF103 和CF56、CF106对亲本及其F1 中的扩增结果
注：A为共显性；B为偏父型；C为偏母型。
Figure 3. Predominant products of primers CF015,CF043,CFR032,CF103,CF56,and CF106
表 1 17 份辣椒种质及特定亲本和后代
Table 1. Seventeen typical C. annuum germplasms and specific parents and F1 hybrids
PA001 黄椒 PA002 黄椒 PA003 黄椒 PA004 黄椒 PA005 朝天椒 PA006 牛角椒 P181-2-6(母) 牛角椒 PA007 野生椒 PA008 朝天椒 PA009 羊角椒 PA010 牛角椒 PA011 牛角椒 PA012 牛角椒 P230-2-5(父) 牛角椒 PA013 牛角椒 PA014 牛角椒 PA015 牛角椒 PA016 牛角椒 PA017 牛角椒 T2(F1) 牛角椒 
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表 2 辣椒 EST 中SSR 出现频率
Table 2. Occurrence of SSRs in ESTs of C. annuum
重复类型 基元
种数NSSR数 占全部SSR
的比例/%出现频
率/%平均距离
/bp二核苷酸 10 1476 44.15 1.24 3.88×104 三核苷酸 36 483 14.45 0.41 1.19×105 四核苷酸 22 97 2.9 0.08 5.90×105 五核苷酸 37 159 4.76 0.14 3.60×105 六核苷酸 182 1128 33.74 0.95 5.08×104 总计 287 3343 100 2.82 1.72×104
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表 3 辣椒EST-SSR优势基元重复类型
Table 3. Predominant types of SSR motifs in ESTs of C.annuum
重复类型 重复
基元数量 优势重复基元
占本重复基元
的比例/%SSR中出
现频率
/%发生
频率
/%二核苷酸 GA/TC 614 41.60 18.37 0.52 AG/CT 429 29.07 12.83 0.36 AT/TA 330 22.36 9.87 0.28 TG/CA 67 4.54 2.00 0.06 AC/GT 62 4.20 1.85 0.05 三核苷酸 TCC/GAA 49 10.14 1.47 0.04 AAT/ATT 46 9.52 1.38 0.04 ATA/TAT 43 8.90 1.29 0.04 TAA/TTA 40 8.28 1.20 0.03 CTG/CAG 39 8.07 1.17 0.03 TGA/TCG 38 7.87 1.14 0.03 AGA/TCT 36 7.45 1.08 0.03 CTT/AAG 34 7.04 1.02 0.03 四核苷酸 TAAT/ATTA 35 36.08 1.05 0.03 TTTA/AAAT 16 16.49 0.48 0.01 AAAG/ATTT 7 7.22 0.21 0.01 AATA/TATT 7 7.22 0.21 0.01 五核苷酸 ATATA/TATAT 79 49.69 2.36 0.07 GTTTG/CAAAC 11 6.92 0.33 0.01 六核苷酸 TCATGG/CCATGA 116 10.28 3.47 0.10 ACGAGA/TGCTCT 92 8.16 2.75 0.08 CTGCTC/GAGCAG 63 5.59 1.88 0.05
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表 4 辣椒EST-SSR 基元重复长度
Table 4. Predominant types of SSR motifs in ESTs of C.annuum
重复类型 变化范围
/bp平均长度
/bp二核苷酸 18-152 43.82 三核苷酸 21-120 25.09 四核苷酸 20-32 21.86 五核苷酸 20-30 20.57 六核苷酸 18-54 18.10
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表 5 不同核苷酸重复引物的扩增有效率和多态性比例
Table 5. Proportions of effective and polymorphic primers for different types of motifs
重复基元 合成
引物数有效
扩增数有效扩增
比例/%具有多态性
的引物数多态性
比例/%二核苷酸 50 50 100.00 23 46.00 三核苷酸 49 49 100.00 18 36.73 四核苷酸 10 8 80.00 2 20.00 五核苷酸 11 10 90.90 1 9.10 六核苷酸 80 79 98.75 27 33.75 总计 200 196 98.00 71 35.50
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