Rapid Detection of Monoclonal Antibody against Vibrio anguillarum by Using Conjugated Colloidal Gold
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摘要: 以灭活鳗弧菌（SMW5）全菌为抗原，应用杂交瘤技术，制备了鳗弧菌单克隆抗体3株，分别命名为1H9、1C12、6F8，细胞亚类分别为IgG2a、IgM、IgG2b，其中1H9腹水效价为1：6.4×105。制备鳗弧菌（SMW5）兔多克隆抗体，效价为1：3.2×105。应用纳米胶体金颗粒标记单克隆抗体1H9并制备金标垫，抗鳗弧菌（SMW5）兔多克隆抗体与羊抗鼠抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜，分别作为检测线T和质控线C，建立鳗弧菌的胶体金免疫层析快速检测方法。经过对试纸条的特异性和灵敏度测定，结果表明：试纸条与嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、副溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌，7种水产常见病原菌没有交叉反应，与鳗弧菌特异性反应，检测灵敏度为6.3×104cfu·mL-1，检测所需时间低于10 min。所制备的鳗弧菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高和适应基层生产推广应用等优点。Abstract: Vibrio anguillarum, strain SMW5, were inactivated by formaldehyde to be used as the antigen for immunizing Balb/c mice. Three hybridomas strains secreting monoclonal antibodies (McAb) against V. anguillarum were obtained and named as 1H9, 1C12, and 6F8 with the isotypes of IgG2a, IgM, and IgG2b, respectively. The titers of 1H9 in ascites of Balb/c mice were 1:6.4×105. The polyclonal antibody was prepared against V. anguillarum, with a titer of 1:3.2×105. A rapid, accurate and easy gold immunochromatographic lateral flow assay methodology (GICA) was developed for detecting V. anguillarum. The monoclonal antibody, 1H9, was conjugated with colloidal gold as a signal generator on the conjugate pad. The polyclonal antibody was used as a capture antibody for the test line (T), and the goat anti-mouse IgG antibody as the capture antibody for the control line (C) on nitrocellose membrane. A GICA test strip was assembled with an absorbing pad, a conjugate pad, and a nitrocellose membrane sprayed with the capture antibody. The sensitivity of the GICA test strip towards V. anguillarum was high with a detection limit of 6.3×104cfu·mL-1. The specificity of the assay showed no cross-reaction with 7 other aquaculture pathogens, including Aeromonas hydrophila, A. cavia, A. sobria, Edwardsiella tarda, and Streptococcus agalactiae. An accurate confirmation could be completed in 10 min for the assay. It appeared that the newly developed method using the GICA test strip was adequate for V. anguillarum detection.
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图 2 试纸条检测鳗弧菌(SMW5)灵敏度试验结果
Figure 2. Sensitivity of gold test strip on V. anguillarum (SMW5)
表 1 单克隆抗体上清液效价及亚类鉴定
Table 1. Titers and subclasses of McAb supernatant
单抗株 效价 IgG亚类 1H9 1∶6400 IgG2a 1C12 1∶3200 IgM 6F8 1∶800 IgG2b 
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表 2 单克隆抗体特异性试验
Table 2. Specificity test on McAbs
菌株 交叉反应结果 1H9 1C12 6F8 鳗弧菌(SMW5) ＋ ＋ ＋ 鳗弧菌(参考株) ＋ ＋ ＋ 溶藻弧菌(Js60517NA1) － ＋ － 创伤弧菌(FJ04-L1) － ＋ － 副溶血弧菌(ATCC17802) － － ＋ 哈维氏弧菌(03152) － － ＋ 河流弧菌(参考株) － － － 嗜水气单胞菌(ML316) － － － 嗜水气单胞菌(JS01-1) － ＋ － 温和气单胞菌(Fp60325NA) － － － 非0-1群霍乱弧菌(96-2) － － ＋ 类志贺邻单胞(LCCi190625) － － － 无乳链球菌(070717LL) － － － 注：“－”表示阴性结果，“+”表示阳性结果。
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表 3 单克隆抗体灵敏度
Table 3. Sensitivity test on McAbs
细胞株 McAb 灵敏度 /
(cfu·mL-1)1H9 4×103 1C12 2×103 6F8 8×103
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表 4 鳗弧菌胶体金试纸条交叉反应测试结果
Table 4. Cross reactivity of colloidal gold test strip on 10 bacteria strains
序号 菌株 结果判定 1 鳗弧菌(SMW5) + 2 鳗弧菌(标准株) + 3 鳗弧菌(1H00003) ± 4 副溶血弧菌(ATCC17802) - 5 溶藻弧菌(Js60517NA1) - 6 创伤弧菌(FJ04-L1) - 7 嗜水气单胞菌(ML316) - 8 温和气单胞菌(Fp60325NA) - 9 豚鼠气单胞菌(AB40511NA1) - 10 迟缓爱德华氏菌(AL60306NA1) - 11 阴性对照(BSA) - 注：“－”表示阴性结果；“+”表示阳性结果；“±”表示弱阳性结果。
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表 5 试纸条检测鳗弧菌(SMW5)灵敏度试验结果
Table 5. Sensitivity of gold test strip on V. anguillarum (SMW5)
序号 菌体浓度/
(cfu·mL-1)检测结果 1 6.3×103 - 2 6.3×104 ± 3 6.3×105 + 4 6.3×106 + 5 6.3×107 + 6 6.3×108 + 注：“－”表示阴性结果；“+”表示阳性结果；“±”表示弱阳性结果。
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[1] BIOSEA E G, AMARO C, ESTEVE C,et al.First record of Vibrio vulnificus biotype 2 from diseased European eel,Anguilla anguilla[J].Fish Dis,1991,14:103-109. doi: 10.1111/jfd.1991.14.issue-1 [2] 吴后波,潘金培.弧菌属细菌及其所致海水养殖动物疾病[J].中国水产科学,2001,(3):90. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZSCK200101020.htm [3] 刘杰.欧鳗弧菌病的诊断与防治技术[J].渔业致富指南,2001,(13):42. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YYZF200113043.htm [4] 莫照兰,茅云翔,陈师勇,等.一株牙鲆皮肤溃烂症病原菌的鉴定[J].微生物学报,2002,42(3):263-269. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-WSXB200203000.htm [5] 郭杨柳,吴楠,房海,等.大菱鲆病原鳗弧菌的检验与分析[J].生物技术通报,2015,31(11):222-227. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SWJT201511029.htm [6] 肖慧,唐学玺,陈吉祥,等.鳗弧菌W-1对花鲈鱼苗致病性的初步研究[J].海洋科学,2008,32(3)36-39. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HYKX200803007.htm [7] 肖慧,李军,徐怀恕,等.鲈鱼苗烂鳃、烂尾病病原的研究[J].青岛海洋大学学报,1999,(1):89. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-QDHY901.013.htm [8] 李清禄,陈强.海水网箱养殖大黄鱼细菌性病原鉴定与感染治疗研究[J].应用与环境生物学报,2001,7(5):489. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YYHS200105017.htm [9] 向赟,王刚,陈兆明,等.不同温度条件下鳗弧菌和白斑综合症病毒对凡纳滨对虾的致病性[J].热带生物学报,2015,6(1):11-17. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HNNX201501003.htm [10] EGIDIUS E.Vibriosis:pathogenicity and pathology[J].Aquaculture,1987,67:15. doi: 10.1016/0044-8486(87)90004-4 [11] 夏永娟.抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的研制[D].西安:第四军医大学,2001. [12] 余俊红,姚婓,王宝坤,等.应用间接ELISA技术快速检测花鲈病原菌--鳗弧菌[J].高技术通讯,2001,11(7):23-27. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-GJSX200107004.htm [13] 余俊红,姚斐,俞勇.应用间接荧光抗体技术快速检测花鲈病原菌--鳗弧菌[J].海洋水产研究,2002,23(2):38-44. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HYSC200202006.htm [14] 邹玉霞,莫照兰,高光,等. 间接ELISA技术在病原性鳗弧菌SMP1快速检测中的应用[J].海洋科学,2007,31(6):75-78. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HYKX200706014.htm [15] 边慧慧,蒋继志,黄倢,等.双抗原夹ELISA检测抗鳗弧菌抗体效价的研究[J].科技信息,2009,(7):41-42. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-KJXX200907338.htm [16] 吴斌.豚鼠气单胞菌快速检测间接ELISA法的建立[J].福建水产,2006,(4):48-51. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-FJSC200604013.htm [17] 徐志凯.实用单克隆抗体技术[M].西安:陕西科学技术出版社,l992:27-102. [18] 辛志明.迟缓爱德华氏菌胶体金快速检测试纸的研制[J].中国海洋大学学报,2011,41(10):40-44. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-QDHY201110008.htm [19] 吴圆圆.鳗弧菌快速检测试纸条的研制[D].上海:华东理工大学,2014. [20] 黄艺丹,汪开毓,郑建,等.鱼类致病性豚鼠气单胞菌单克隆抗体一胶体金检测方法的建立[J].水生生物学报,2010,34(3):509-516. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10626-2010244619.htm [21] 辛志明,樊海平,吴斌,等. 嗜水气单胞菌胶体金快速检测试纸条的研制[J].中国兽医科学,2012,42(7):708-712. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGSY201207011.htm [22] 辛志明,樊海平,吴斌,等.豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析试纸条的研制[J].水产学报,2009,33(4):679-684. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SCKX200904020.htm [23] 王蓓,梁军,简纪常,等.溶藻弧菌免疫胶体金快速检测试纸条的制备[J].广东海洋大学学报,2013,33(4):49-55. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SHDX201304010.htm [24] 刘亦娟,徐晓丽,孙金生,等.哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条的制备[J].水产学杂志,2015,28(2):6-11. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SCXZ201502002.htm [25] 秦璞,胡晓,张在阳,等.鱼类致病性迟钝爱德华氏菌胶体金快速检测试纸的研制[J].华东理工大学学报:自然科学版,2011,37(3):330-334. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HLDX201103015.htm [26] LYEDY D M,PHELPS C J AND WILKINS T D.Monoclonal and specific polyclonal antibodies for immunoassay of Clostridium dificile ToxinA[J].Journal of clinical microbiology,1985,21(1):12-14. http://cn.bing.com/academic/profile?id=394574602d051c86d09daf70dc51c08b&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn -
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