木豆Cajanus cajan(L.)Millspaugh系豆科木豆属常绿灌木^[1]，木豆叶具有很高的药用价值，研究表明木豆叶的主要成分是芪类化合物和黄酮类化合物，具有降血脂^[2]、抗老年性痴呆、抗骨质疏松^[3]等多种药理活性^[5]。木豆的化学成分研究表明，牡荆苷和异牡荆苷是含量较高的黄酮类化合物^[5-6]，具有清除自由基、降血压、止痉挛、抗菌、抗辐射等作用^[7-10]。

提取液的分离浓缩纯化是现代中药制药的关键操作之一^[11]。膜分离浓缩工艺可在常温下进行，应用于一些中药制剂^[12]和食品成分^[13]的分离和浓缩。膜分离技术操作简便，分离过程无相变，节约能耗，成本低。采用膜分离技术浓缩提取液，可根据分子性质，分离不同分子量的物质，显著提高分离效率。

本研究超声提取木豆叶中黄酮类物质，提取液经抽滤，去除提取液中的木豆粉末残渣。但木豆叶提取液中固形物的含量很低，稀提取液除渣后必须加以分离浓缩以提高固形物的浓度，从而提高目标活性物质的浓度。通过膜分离浓缩可以减少干燥时间，提高干燥效率。为此，本研究将木豆叶提取液进行膜组合分离纯化，分别对各个透过液与浓缩液进行取样，采用紫外分光光度计和高效液相色谱仪对样品进行化学成分分析，将各个浓缩液进行旋转蒸发干燥，称量干物质，计算活性成分的纯度。

1.   材料与方法

1.1   试验材料与设备

材料：木豆叶，采自福建福州福建省农业科学院埔垱基地。

试剂：芦丁、牡荆苷和异牡荆苷标准品，Al (NO₃)₃、乙醇、NaNO₂、NaOH等试剂均为分析纯。

设备：可见分光光度计(T6新世纪)，超声波清洗机(SB-5200DTDN)，高速冷冻离心机(Centrifuge5804R)，电热鼓风干燥(DHG-9240A)，粉碎机(MJ-25BM06A)，0.45和0.22 μm微孔滤膜，80目筛网，卷式多功能设备(RNF-0460)，微滤膜心(SMM-901)，超滤膜心(MSU-110)，纳滤膜心(SMN-130)，旋转蒸发器(RV10)，高效液相色谱仪(Agilent 1200)。

1.2   木豆叶提取液膜浓缩纯化

在一定压力下，当原料液流过膜时，膜上密布的许多细小的微孔只允许水及溶液中比孔径细小的物质通过而成为透过液，而原料液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，从而实现分离和浓缩原液的目的。

1.3   木豆叶提取液膜组合浓缩工艺流程

以木豆叶为样品原料，经烘干、粉碎、过筛后，称取一定量样品，将样品进行超声提取^[14]。将提取液通过减压抽滤进行初步过滤，除去虑渣，得木豆叶提取液约10 L。

将上述木豆叶提取液通过卷式膜多功能设备进行膜组合分离浓缩。确定膜组合为微滤膜、超滤膜和纳滤膜。膜分离工艺路线为：木豆叶提取液先进行微滤膜分离浓缩，得到微滤膜截留的浓缩液和微滤透过液；将微滤透过液继续进行超滤膜分离浓缩，得到超滤膜截留的浓缩液和超滤透过液；最后将超滤的透过液进行纳滤膜分离浓缩，最终得到纳滤膜截留的浓缩液和纳滤透过液。工艺流程如图 1所示。

图  1  膜工艺流程

Figure  1.  Flow chart of membrane filtration process

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卷式膜多功能设备的3个膜浓缩过程均在室温条件下进行，开机后，通过调节控压阀门调节压力，在溶液浓度较低时，控制在较小压力范围即可得到适宜的膜通量，浓度较高时，溶液黏性增大，可通过调节控压阀门，增大压力，以达到适宜膜通量，但浓缩过程，压力并非越大越好，压力应控制在30 bar以内为宜。不同的膜在进行浓缩时，因其材质和孔径大小等方面的不同，同样压力下，其得到的膜通量不同。因此，为达到适宜的膜通量，需在限定范围内调节压力。

经过膜浓缩处理后，最终得到微滤、超滤和纳滤的浓缩液以及纳滤透过液。将微滤、超滤、纳滤浓缩液分别进行旋转蒸发至干，得到各个浓缩液的干物质。分别测定各浓缩液的总黄酮含量。

2.   结果与分析

2.1   木豆叶提取液的微滤膜分离过程

微滤过程主要截留木豆叶提取液中的悬浮颗粒和大分子物质。此过程对有效成分的保留率很高，一般损失少于10%，为进一步的膜分离浓缩起到初步分离处理的作用。微滤过程的流量变化如图 2所示。机器的流量最好控制在12 L·h^-1以内，这样能有效控制膜被污染的速度，因此微滤膜分离过程压力控制在10 bar最佳。微滤过程开始时流量较大，随着时间的延长，通量有所下降，由于微滤膜截留了物质附着在膜上，污染膜，从而阻碍提取液透过膜，使通量不断减小。

图  2  微滤、超滤、纳滤过程膜流量变化

Figure  2.  Membrane fluxes in microfiltration, ultrafitration, and nanofiltration filtration process

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2.2   木豆叶提取液的超滤膜分离过程

经微滤除去悬浮颗粒和大分子物质后，微滤透过液采用超滤膜(截留分子量1 000 Da)分离浓缩提取液中的有效成分。由于微滤除去的主要是大分子物质，大多数的提取物质尚未去除，留在了微滤透过液中。因此，在超滤膜分离过程中，预达到适宜的流量(即12 L·h^-1以内)，需适当调节压力，控制在28 bar左右。压力过大，容易在短时间内使膜污染而影响分离效果和分离效率。超滤过程的膜流量变化如图 2所示，由于压力较高，开始的流量也较大，在处理的0.5 h内，流量快速下降。超滤膜孔径小于微滤膜，使较多物质被截留，部分截留物质堵塞膜孔，影响膜通量的大小。溶液处理前为绿色，经超滤膜分离后透过液颜色变淡，而浓缩液与处理前相比变深，呈墨绿色。

2.3   木豆叶提取液的纳滤膜分离过程

大多的物质被截留在超滤浓缩液中，将超滤透过液进行纳滤膜分离浓缩，截留了提取液中的有效成分，得到无色透明的纳滤透过液和绿色纳滤浓缩液。

2.4   膜分离过程的总黄酮含量

用紫外分光光度计分别对膜分离浓缩的浓缩液进行测量。得到如表 1所示的总黄酮含量等结果。

表  1  膜分离过程的总黄酮含量

Table  1.  Total flavonoids at various stages of membrane filtration process

测试溶液	浓度/ (μg·mL-1)	体积 /mL	总黄酮质量 /mg	总提取物质量 /g	总黄酮纯度 /%	总黄酮分布 /%
提取原液	1193.96	10200	12178.43	127.00	9.59	100.00
微滤浓缩液(A)	1466.61	1310	1921.26	86.00	2.23	15.78
超滤浓缩液(B)	4225.96	1347	5692.37	26.76	21.27	46.74
纳滤浓缩液(C)	4025.00	1071	4310.78	8.60	50.13	35.40
纳滤透过液(D)	-	5100	-	-	-	-

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由表 1可知在各种膜分离过程中浓缩液的总黄酮含量分布情况。微滤过程主要除去溶液中的大分子及悬浮物，且膜分离是个循环浓缩过程，大部分分子小于微滤孔径的物质(包括黄酮类物质)均能通过膜，少部分由于膜过载等原因被截留。因此，微滤浓缩液中含有少部分黄酮类物质。超滤膜截留的浓缩液总黄酮含量的分布最高，但总黄酮的纯度只有21.27%。纳滤浓缩液的总黄酮含量分布略低于超滤浓缩液，而其总黄酮的纯度是超滤浓缩液的2倍多。因此在分离纯化的过程中，可以根据不同的目的适当选择不同的膜进行分离纯化。为得到纯度较高的浓缩物质可选择微滤-超滤-纳滤膜体系，若为最大程度的保留有效物质的含量，则可选择微滤-纳滤膜体系。

在超滤浓缩液中截留了除黄酮以外的物质，使得总黄酮的纯度低。纳滤透过液呈无色透明液体，且未检测出总黄酮的含量，说明总黄酮的含量低于仪器的最低检测限，可能纳滤透过液中黄酮含量过低甚至没有，纳滤膜分离过程可作为液体除溶剂的浓缩过程。

经过膜分离浓缩体系，提取液的体积，总黄酮含量均有所损失，分析其原因主要是乙醇提取木豆叶得到的可溶性固形物黏性较大，部分黏性物质黏附在膜或者仪器上，同时操作过程中部分液体残留在仪器中，从而造成部分损失。

2.5   纳滤浓缩液的牡荆苷与异牡荆苷含量

牡荆苷和异牡荆苷是木豆中含量较高的黄酮类物质，且具有广泛的药用价值，为此对纳滤浓缩液中黄酮单体牡荆苷、异牡荆苷进行高效液相色谱分析。纳滤浓缩液中含有较高的牡荆苷和异牡荆苷，色谱图(图 3)显示，牡荆苷峰的保留时间为22.683 min，异牡荆苷峰的保留时间为32.429 min，在纳滤提取物中牡荆苷含量为0.069 mg·g^-1，异牡荆苷为4.31 mg·g^-1。

图  3  纳滤浓缩液色谱

Figure  3.  HPLC chromatogram of filtrate from nanofiltration

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3.   讨论与结论

本研究采用多级膜(微滤-超滤-纳滤)分离纯化木豆叶提取液。在微滤、超滤和纳滤3个膜处理过程中，其膜通量变化都比较一致，开始时膜通量较大，接着随着时间的推移，膜通量较迅速地减小，最后膜通量趋于稳定。膜通量逐渐减小是由于膜在分离的过程中膜不断截留的滤液中的物质附着在膜上，从而阻碍提取液透过膜，使得通量不断减小，随着时间的推移膜通量达到一定相对稳定状态，这是因为膜上附着的物质达到一个比较平衡的状态。

采用多级膜(微滤-超滤-纳滤)分离纯化木豆叶提取液，有效成分保留率达到了97.92%，溶剂除去率达到了50%，提取液得到了浓缩。测定各个部分浓缩液与透过液的总黄酮含量可知，膜浓缩过程中，各个浓缩液中均含有黄酮类物质，且含量和纯度均不同。黄酮类物质主要存在超滤浓缩液和纳滤浓缩液中，由此推测出大多数黄酮类物质的分子量小于微滤膜的孔径大小，而大于超滤膜孔径，从而使得大部分黄酮类物质被截留在超滤浓缩液中。纳滤透过液呈无色透明液体，用紫外分光光度计检测时未检出，含量低于最低检测限。因此纳滤膜分离过程在一定程度上起到了去除溶剂浓缩样品的作用。在生产过程中可以根据不同的要求选择不同的膜分离组合。

膜分离技术操作简便，分离过程无相变，节约能耗，成本低。采用膜分离技术浓缩提取液，可根据分子性质，分离不同分子量的物质，显著提高分离效率。因此可以先分析目标产物的分子量大小，来选择适当的膜分离浓缩体系进行分离浓缩液体，从而得到浓度更高，更好的目标产物。