植物防御体系的组成主要包括组成抗性(constitutive resistance)和诱导抗性(induced resistance)，其抵御植食性昆虫和病原微生物等的能力受自身和环境等多种因素的综合影响^[1-3]。不同植物在与这些外部胁迫长期协同进化的过程中，逐步特化出自身特有的化学防御机制^[4]。黑芥子酶-硫代葡萄糖苷防御体系，也称“芥子油苷炸弹”(mustard oil bomb)^[5]，是十字花科植物诱导性防御机制中的核心部分，是其防虫抗菌的有效“武器”^[6-7]。当十字花科植物正常生长时，硫代葡萄糖苷(也称为芥子油苷或简称硫苷，glucosinolate)，与植物体内的黑芥子酶分别独立储存在细胞内液泡和膜质细胞器的表面中；当其受到昆虫取食或病原菌侵染，造成植物细胞完整性被破坏时，体内的黑芥子酶与底物硫苷相遇并将其代谢为异硫氰酸酯(isothiocyanate，ITCs)、腈类物质(nitrile)和硫氰酸酯(thiocyanate)等有毒的氰类化合物，从而起到抵御外部有害生物侵害的作用^[8]。

虽然十字花科植物黑芥子酶-硫代葡萄糖苷防御体系的产物对大多数植食性害虫具有较高的毒性，但是不同的昆虫有其对应的解毒机制^[9-11]。对于寡食性小菜蛾而言，其幼虫的中肠内含有大量的硫代葡萄糖苷硫酸酯酶(glucosinolate sulfatase，GSS)，能够与黑芥子酶竞争性的结合植物硫苷并将其水解为无毒的脱硫硫代葡萄糖苷^[12]。此外，基因组信息进一步揭示小菜蛾存在2个序列相似且串联分布的GSS基因GSS1和GSS2。因此，GSS家族成员被认为是小菜蛾特异性取食十字花科植物的关键蛋白^[13]。

针对人类GSS基因家族的研究发现，所有的GSS均需要在活性部位(氨基酸序列为：ALCSPARTAVLTG)上经硫酸酯酶修饰因子1(sulfatase modifying factor 1，SUMF1)将半胱氨酸残基(cysteine residue)修饰成Cα-甲酰甘氨酸(Cα-formylglycine，FGly)，才具有催化活性^[14-15]。同时，在脊椎动物中还存在一个与SUMF1序列相似的SUMF2，SUMF2能够与SUMF1结合成为二聚体或直接结合硫酸酯酶从而调控对硫酸酯酶的修饰效率^[16]。然而，在小菜蛾基因组中，一共鉴定得到2个SUMF1基因SUMF1a和SUMF1b，未发现有SUMF2^{[13, 17]}。

小菜蛾虽然能够广泛取食不同类型的十字花科植物，但对不同寄主的适应能力存在差异^[18]，可能是由于不同类型的十字花科植物中硫苷的类型和含量不尽相同^[19-20]。同时，将长期取食人工饲料的小菜蛾转移至不同种植模式和不同叶龄的甘蓝后，幼虫存活率显著不同^[21]。由于GSS在小菜蛾适应寄主过程中的重要作用^[12]，因此推测饲料品系小菜蛾在适应寄主植物的过程中，GSS和SUMF1这些与硫苷代谢相关基因的表达及其调控可能起到了重要作用。人工饲料品系小菜蛾由于可以人为调控培养基中各种成分的组成和比例，是研究小菜蛾对富含硫苷的寄主植物的适应能力及其分子机制的理想材料。因此，本研究以本课题组已建立且取食特性存在差异的2个小菜蛾饲料品系(长期未接触硫苷)作为研究对象，探究硫苷代谢相关基因GSS1、GSS2及其修饰因子SUMF1a和SUMF1b在不同发育阶段的表达模式，并将两种人工饲料品系小菜蛾转移至寄主植物萝卜，检测其取食过程中适合度参数和靶标基因表达模式的变化，分析长期未接触硫苷的小菜蛾对富含硫苷的寄主植物的适应能力及其与GSS和SUMF1基因表达水平变化之间的关系，旨在揭示小菜蛾硫苷代谢途径在其对寄主适应性方面的功能。

1.   材料与方法

1.1   供试小菜蛾

供试虫源为两种人工饲料品系小菜蛾(AD和G88)。其中，AD品系建立于2015年，本地饲养已经超过50代；G88品系于2016年10月由康奈尔大学的Shelton教授惠赠，此前已在饲料上饲养683代，本地化饲养至今已31代。2种人工饲料品系小菜蛾(AD和G88)幼虫的食源均为未添加菜粉的人工饲料(Frontier Scientific Services，USA)。2种品系小菜蛾饲养条件一致，温度、光周期以及相对湿度分别设置为(25±1)℃、L:D=16:8、70%~80%。成虫饲养使用10%的蜂蜜，其中G88和AD人工饲料品系成虫产卵时远离任何植物源气味，以避免植物源挥发物质对虫体内相关基因表达量的影响。转寄主试验供试萝卜种子为南半洲白萝卜品系，将其置于人工气候室中培养，使用子叶喂食小菜蛾，饲养条件同饲料品系。

1.2   样本的收集、RNA提取及cDNA合成

为研究AD和G88品系小菜蛾不同发育阶段硫苷代谢相关基因表达模式，试验设置了卵、1、2、3、4龄、蛹、雌雄成虫8个处理。除卵、1龄和2龄幼虫的收集量为覆没1.5 mL离心管(Axygen)底部，其他每个阶段(3龄幼虫、4龄幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫)分别收集3只虫体，每个处理设置3个生物学重复。转寄主试验中，将AD或G88品系初孵幼虫接于萝卜子叶上，分别收集饲养了一代和两代的4龄幼虫的中肠样本，每个重复8只，于磷酸盐缓冲液(PBS)中除去肠道内容物，以AD和G88品系4龄幼虫的中肠作为对照。所有样本收集完毕后立即放于液氮中速冻，保存在-80℃超低温冰箱，用于后续RNA的提取。

所有样本的RNA提取使用TRIzol^®试剂(Invitrogen，Guangzhou)^[17]，提取后的RNA利用分光光度计测量RNA的浓度和质量，并进行琼脂糖凝胶电泳验证其完整性。RNA反转录之前先利用gDNA wiper Mix(Vazyme)试剂盒去除基因组DNA，然后采用HiScript^®Ⅱ qRT SuperMix(Vazyme)试剂盒合成cDNA。

1.3   荧光定量PCR

利用Premier 5软件(Version 5.00)设计GSS1、GSS2、SUMF1a和SUMF1b的特异性引物，以小菜蛾核糖体蛋白RPL32作为内参基因(NCBI登录号：AB180441)。引物由福州铂尚生物技术有限公司合成(表 1)，荧光染料使用GoTaq ^® qPCR Master Mix(Promega)，反应总体系为20 μL，包括GoTaq ^®; qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH₂O 7 μL，模板2 μL。荧光定量PCR仪为Bio-Rad(c1000 Touch^TM Thermal Cycler)，反应程序为：预变性95℃，5 min，变性95℃，15 s，退火温度58℃，30 s，44个循环。其中溶解曲线根据仪器默认设置：包括60℃ 5 s，随后以0.5℃增幅升至95℃。

1.4   人工饲料品系小菜蛾取食萝卜子叶适合度的观测

采用自制的卵卡收集饲料品系(AD和G88)小菜蛾的受精卵，置于不含人工饲料的培养皿，待其孵化后收集足够量的初孵幼虫分别分成两组，其中一组将其放置在萝卜子叶上连续饲养两代，分别将其命名为AD-Trans-G1(或G88-Trans-G1)和AD-Trans-G2(或G88-Trans-G2)；另外一组依然放置在人工饲料上饲养，命名为AD-Gck(或G88-Gck)。按照材料与方法中1.1的流程饲养。每组处理包括60只单独饲养的小菜蛾，每天观测并统计相关适合度参数。其中，幼虫每日存活率为：每日存活的幼虫数除以初始虫数60；发育历期为：初孵幼虫到预蛹所用的时间(d)；蛹重为结蛹后第2 d单只称量所得的重量(g)。

表  1  荧光定量PCR引物序列

Table  1.  Sequences of primer pairs used for q-PCR

基因	引物对		产物长度/bp
	序列	退火温度/℃
GSS1	F: AGGACCCTTGTGAGCTTCGT R: ACTTGGGGTCAGCGACGT	58	129
GSS2	F: CGGACCCTTGCGAGCTGCGA R: CCCTGGGGTCAGCGGTGA	58	129
SUMF1a	F: CATAGAAGCGGACAACGAGG R: TCCACGAACTCACTGAAATC	58	102
SUMF1b	F: ACATTTCCCAGCCATAACTC R: ACTCCCAGACATTCCCGACA	58	112
RPL32	F:CAATCAGGCCAATTTACCGC R:CTGGGTTTACGCCAGTTACG	58	109

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1.5   数据分析

采用2^-ΔCt法计算目的基因的表达量，其中ΔCt为目的基因的Ct值减去内参基因所得的Ct值。荧光定量结果和小菜蛾生物学参数利用GraphPad Prism(版本5.01)绘制成图。不同发育阶段基因表达模式的数据采用单因素方差分析法进行差异显著性检验，后使用Tukey法进行数据间的多重比较。人工饲料品系喂食萝卜子叶中，生存曲线数据采用Log-rank(Mantel-Cox)分析方法，基因表达模式数据采用独立样本t检验。

2.   结果与分析

2.1   硫苷代谢相关基因在不同发育阶段的表达模式

在2种饲料品系中，两个GSS基因均在3龄和4龄幼虫中大量表达。GSS1基因在AD品系与GSS2基因在G88品系中的表达模式相似，在3龄幼虫表达量显著高于4龄幼虫(图 1-A、D)；GSS2基因在AD品系与GSS1基因在G88品系中的表达模式相似，在4龄幼虫表达量显著高于3龄幼虫(图 1-B、C)。

图  1  GSS1和GSS2在不同发育阶段的表达模式

注：A、B、C、D分别为AD-GSS1、G88-GSS1、AD-GSS2、G88-GSS2的表达模式。EGG为卵，L1~L4为幼虫1~4龄期，P为蛹，FA为雌性成虫，MA为雄性成虫。数据以平均值+标准误的形式呈现于图表，不同小写字母表示数据经单因素方差分析后，利用Tukey多重比较检测在0.05水平下存在显著差异。图 2同。

Figure  1.  Stage-specific expression patterns of GSS1 and GSS2

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在2种饲料品系中，SUMF1的表达模式较为多样。AD品系中，SUMF1a在4龄幼虫中表达量都相对较高，而SUMF1b的表达量从3龄幼虫开始至成虫的发育过程中无明显差异(图 2-A、C)；G88品系中，SUMF1a在3龄幼虫和雄成虫中呈现高表达，但SUMF1b仅在雄成虫期相对高表达(图 2-B、D)。

图  2  SUMF1a和SUMF1b在不同发育阶段的表达模式

注：A、B、C、D分别为AD-SUMF1a、G88-SUMF1a、AD-SUMF1b、G88-SUMF1b的表达模式。

Figure  2.  Stage-specific expression patterns of SUMF1a and SUMF1b

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2.2   转换寄主对小菜蛾适合度参数的影响

G88品系小菜蛾转食萝卜子叶的第一代和第二代(G88-Trans-G1和G88-Trans-G2)幼虫的存活率皆显著低于对照组(G88-Gck)，AD第一代和第二代(AD-Trans-G1和AD-Trans-G2)幼虫的存活率相比较于对照组(AD-Gck)虽然略微下降，但差异并不显著(图 3-A、D)。G88取食萝卜子叶第一代和第二代幼虫的发育历期显著长于G88-Gck，但在AD品系中，仅第二代(AD-Trans-G2)幼虫的发育历期相比对照组(AD-Gck)显著延长(图 3-B、E)。相对于G88-Gck，取食植物后个体的蛹重在随后两个世代都显著下降，AD品系中也呈现同样规律(图 3-C、F)。

图  3  转换寄主对小菜蛾存活率、发育历期和蛹重的影响

注：A、D分别为G88品系和AD品系幼虫存活率，B、E为幼虫发育历期，C、F为蛹重。G88(AD)-Gck为长期取食人工饲料的小菜蛾G88(AD)品系，G88(AD)-Trans-G1、G2为G88(AD)品系小菜蛾初孵幼虫取食萝卜子叶第一代、第二代。A和D采用Log-rank (Mantel-Cox)分析方法进行两两比较，B、E、C、F采用独立样本t检验；*表示P < 0.05，***表示P < 0.001。

Figure  3.  Effect of host shift on survival rate, developmental time and pupal weight of artificial diet stain of P. xylostella

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2.3   转换寄主对硫苷代谢相关基因表达模式的影响

AD和G88转移至萝卜后，GSS1和GSS2在4龄幼虫中肠的表达量相比原饲料Gck组，皆显著下降(图 4)；但在两个品系中，SUMF1a和SUMF1b基因的表达模式并不一致。在萝卜子叶喂食后的AD幼虫中肠，其SUMF1a的表达量相比原饲料品系(AD-Gck)显著下降，而SUMF1a和SUMF1b的表达量在G88中虽有下降但都未达到显著水平(图 5)。

图  4  饲料品系取食萝卜子叶后GSS1和GSS2基因表达模式

注：A、B为GSS1基因，C、D为GSS2基因。AD(G88)-Gck为长期取食人工饲料的AD(G88)小菜蛾品系4龄幼虫中肠，AD (G88)-Trans-G1、G2为AD(G88)品系小菜蛾初孵幼虫取食萝卜子叶第一代、第二代的4龄幼虫中肠，数据分析方法与图 1相同。*P < 0.05，** P < 0.01。图 5同。

Figure  4.  Expression patterns of GSS1 and GSS2 in artificial diet stains after feeding on radish cotyledons

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图  5  饲料品系取食萝卜子叶后SUMF1a和SUMF1b基因表达模式

注：A、B为SUMF1a基因，C、D为SUMF1b基因。

Figure  5.  Expression patterns of SUMF1a and SUMF1b in artificial diet stains after feeding on radish cotyledons

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3.   讨论

小菜蛾幼虫期，尤其是被称为“暴食期”的3~4龄阶段，对于农业生产危害最为严重^[22-23]。Ratzka等^[12]结合GSS基因在小菜蛾不同发育阶段和组织样品中的表达模式及其GSS的生化实验，认为小菜蛾在幼虫阶段摄入了大量来自寄主植物的硫苷，因此需要在幼虫时期大量表达能够水解不同类型硫苷的GSS进行“解毒”。本研究通过对GSS1和GSS2在两个饲料品系不同发育阶段表达量的研究发现，GSS1和GSS2在幼虫3或4龄显著高表达，说明小菜蛾生长发育进程中可能存在特定信号诱导GSS基因在幼虫阶段特异高表达，不一定需要植物源物质的刺激。同时，在饲料品系小菜蛾转移到萝卜苗子叶饲养后，连续两个世代中的适合度参数均下降，并且均伴随着GSS1和GSS2表达量的显著下调，表明小菜蛾适应寄主植物的能力与硫苷代谢水平密切相关，且植物中存在抑制GSS基因表达的物质。饲料品系小菜蛾在初期的世代呈现出低GSS表达水平、低适应性的现象，符合前人针对GSS家族成员在小菜蛾特异性取食十字花科植物发挥重要作用的观点^[13]，这种现象可能是其适应十字花科寄主植物过程中的必经环节。因此，饲料品系小菜蛾适应十字花科寄主植物的过程与GSS基因表达调控的关系，还需要更多世代的探究。

由于硫酸酯酶均需要SUMF1的修饰，因此发挥主要作用的GSS与SUMF1基因的表达模式很可能具有一定的相似性^[14]。在长期取食寄主植物的FZ品系中SUMF1a与GSS1和GSS2表达模式相符^[17]；AD品系中SUMF1a与GSS1和GSS2的协同表达，而在G88品系并未呈现明显的规律；转食寄主后仅AD品系中SUMF1a的基因表达量与GSS1和GSS2一致都显著下调。因此，GSS与SUMF1基因的表达模式在两种品系小菜蛾不同发育阶段以及转寄主前后的转变，暗示了不同品系中GSS的表达可能存在着主次关系，其活性可能受不同的SUMF1成员所调控，需要体外表达SUMF1蛋白进行生化实验加以验证。

综上所述，硫苷代谢相关基因的表达水平及其调控很可能与小菜蛾适应寄主植物的能力密切相关，是小菜蛾与寄主植物协同进化的重要因子。它为后续基于RNAi技术转基因植物^[24]的开发，以及基于CRISPR/Cas9技术^[25-26]开展小菜蛾遗传调控提供了有效的靶点。