Metabolomic Quenching for Brevibacillus brevis
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摘要: 微生物代谢组学是定性和定量研究分析细胞内外所有低分子量代谢产物,在发酵控制分析、代谢物控制分析及其他组学联用进行菌种改良等方面得到了应用。胞内代谢物种类和浓度变化非常迅速,因此快速冻结代谢反应是非常重要的,所以必须有效率高和可靠的代谢终止方式,减少代谢物的流失。本研究以短短芽胞杆菌JK-2为研究对象,以LC-MS测定为评价标准,考察了5种代谢终止方式对胞内代谢物保留程度。结果表明,冷甲醇/水(含HEPES)代谢终止方式能够保留的代谢物最多,效率最高及其重现性好,在LC-MS正离子模式下,能够提取出3 000多种胞内代谢物。同时也考察了样品在正负模式下测试情况,结果表明正离子模式下能够检测到的代谢物的数目远远超过负离子模式下检测的数目。Abstract: Microbial metabolomics refers to the qualitative and quantitative analysis of all low molecular weight metabolites present in and around the microbial cells.It has been widely applied in combination with other biological fields of studies for fermentation process control,metabolites analysis and microbial species upgrading.In cultivating microorganisms,the intracellular metabolites can turnover in an extremely rapid pace.Consequently,instantaneous fixation of the metabolism is essential for an accurate sampling.And,the development of a highly efficient and reliable quenching protocol is in order for most metabolomical studies.In this study,5 quenching solvent mixtures were evaluated by comparing their intracellular metabolite retention rates measured by LC-MS using the cold methanol extraction method.The results indicated that cold-methanol/water = 3/2(V/V) containing the buffer agent,HEPES,was the most efficient and reproducible quenching agent for Brevibacillus brevis cell culture.Using this method of quenching,more than 3 000 intracellular metabolites were detected in the positive ion ESI mode,which could detect more metabolites than the negative ion ESI mode.
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近年来，随着肠道保健的宣传力度加大和人们保健意识的增强，酸奶、乳酸菌片等乳酸菌制剂的应用和效果越来越受到人们的肯定。活性乳酸菌可促进动物生长，调节胃肠道菌群平衡，抑制有害菌的生长，从而改善胃肠道功能，提高食物消化率和生物效价，降低血清中胆固醇含量，提高机体免疫力等。药用酵母生产在酵母工业中占有重要的地位。酵母水解产物中蛋白质含量为35%~50%、氨基酸含量30%以上，核酸类物质8%以上、碳水化合物含量为35%~40%、脂质含量为2.8%~3.0%。还含有多肽和氨基酸、某些风味强化物质5′-核苷酸及天然的谷氨酸盐[1]。饲喂含酵母抽提物的日粮能促进仔猪生长，显著改善仔猪饲料的转化率[2]；可增强断奶仔猪对疾病的抵抗力、缓解仔猪的断奶应激[3]。
闽东山羊是福建省优良的肉用型山羊地方遗传资源，具有性成熟早、繁殖力高、适应性强、耐粗放饲养、耐湿热气候、屠宰率高、肉质好等特点。由于个体偏小，生长速度较慢，养殖效益低等原因，无法适应目前养殖趋势。
以植物乳杆菌、酵母菌为主导的初级代谢产物，能明显提高反刍动物生产性能，提高饲料营养成分利用价值，改善动物的免疫机能[4]。动物的血清生化指标，既能反映出动物体内实质与外表性能之间的关系，也能反映品种、营养水平、不同生理状况及不同外界环境等特征[5-6]。血清生化指标在其他品种羊上的研究较为多见，一般是研究日粮及日粮添加剂的使用效果或是判断品种及品种杂交后代适应性问题等[7-10]。目前针对闽东山羊的血清生化指标的研究较少。为了转变闽东山羊传统粗放的放牧方式，提高其生产性能和机体免疫力等，本试验采用酵母菌和乳酸菌发酵产物为添加剂，研究其对圈养闽东山羊生产性能和血清生化指标的影响，探讨反刍动物用微生物发酵产物替代抗生素的可能性。
1. 材料与方法
1.1 试验动物及处理
选取45日龄断奶闽东山羊64头，公母各半，平均初始体重(6.95±1.53)kg。随机分成对照组和试验组，每组32头：供试羊平均体重对照组为(6.91±1.55)kg，试验组为(7.08±1.45)kg，差异不显著。两组性别比例一致，公母各半。对照组和试验组日粮相同，试验组在精料中额外添加酵母菌和乳酸菌发酵提取物，添加量为每只羊5 g。分组隔离圈养，圈舍为半开放式，有运动场。
1.2 试验材料
酵母菌和乳酸菌发酵提取产物由四川高福记生物科技有限公司提供，商品名为“刍维健”。经过优选组合培养的特殊功能微生物(乳酸菌类、酵母菌类)，采用单菌种液体发酵工艺，经诱导产生天然、高效、同源、无抗型的复合微生物制剂。主要成分：乳酸菌和酵母菌代谢产生的初级代谢产物(甘露寡糖、多糖、小肽、有机酸)+胞内营养物质(淀粉、蛋白质、脂类物质等)、植物乳杆菌、活性酵母。
1.3 饲喂方法
试验预饲期7 d，试验期30 d，日粮精粗比为35:65(风干基础质量)，其日粮组成和营养水平见表 1。试验期间，每天分别于9:00和15:30喂料。试验组和对照组上午饲喂草料相同，下午对照组常规饲喂，试验组精料中混合“牛羊乐”饲喂。供试羊组间给料量相同，自由采食，自由饮水。
表 1 基础日粮组成和营养水平(风干基础)Table 1. Ingredients and nutritional compositions of experimental diets (on dry basis)日粮组成 含量 营养水平 含量 干草/ % 65 消化能/(MJ·kg-1DW) 10.8 玉米/ % 15 粗脂肪/ % 2.70 豆粕/ % 8 中性洗涤纤维/ % 58.00 豆渣/ % 5 酸性洗涤纤维/ % 32.00 麸皮/ % 4.5 粗蛋白/ % 8.80 氯化钠/ % 0.5 磷酸二氢钙/ % 1 预混料/ % 1 1.4 样品采集
试验结束后，试验组和对照组分别随机选取16头，公母各半，颈静脉采血约10 mL，放置4℃冰箱中静置5 h，待自然凝固血清析出后，1 000 r·min-1离心10 min，将血清样品分2份，迅速置于-40℃冷冻保存待测。一份采用全自动血液生化分析仪测定血清样品的生化指标：分别为总蛋白、白蛋白、球蛋白、IgM、IgG、IgA、谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白。另一份利用酶联免疫检测试剂盒(上海恒远生物科技有限公司，上海)测定闽东山羊血清中IgM、IgG、IgA和IgE的含量。
1.5 指标测定
预饲期7 d后，正式饲喂“牛羊乐”第一天清晨称取每头羊的空腹重，计为初重，饲喂满30 d的第2 d(第31 d)清晨称取每头羊的空腹体重，计为末重，用下式计算各组的平均日增重。
平均日增重=(末重-初重)/饲喂天数。
所有生化指标采用全自动血液生化分析仪：美国贝克曼库尔特(Beckman coulter)公司的AU2007型仪器(中国，上海)，试剂购自宁波美康生物科技有限公司(浙江，宁波)。免疫球蛋白试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司(中国，上海)。
1.6 数据处理
试验数据采用Excel 2007软件进行整理，运用SPSS 17.0软件进行独立样本t检验方法显著性统计分析。结果用平均数±标准差表示。
2. 结果与分析
2.1 酵母菌和乳酸菌提取物对闽东山羊生产性能的影响
从表 2可看出，试验组与对照组的起始体重差异不显著(P>0.05)，说明试验组和对照组羊群体况较一致。饲喂酵母菌和乳酸菌发酵提取混合物30 d后，试验组的期末重和平均日增重显著高于对照组(P < 0.05)，说明酵母菌和乳酸菌发酵提取混合物能够提高闽东山羊的日增重。
表 2 不同处理对闽东山羊体重的影响Table 2. Effect of treatment diet on body weight of Mindong goats项目 对照组 试验组 初重/ kg 6.91±1.55 7.08±1.45 末重/ kg 8.59±1.48b 9.84±1.46a 平均日增重/(g·d-1) 56.00±11.51b 92.13±11.83a 注：同一行数据后不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)，不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下表同。 2.2 酵母菌和乳酸菌提取物对血清生化指标的影响
酵母菌和乳酸菌提取混合物添加饲喂闽东山羊结果发现，与对照组相比，试验组的白蛋白含量、白球比和碱性磷酸酶含量极显著(P < 0.01)降低，谷丙转氨酶含量、总胆固醇含量、高密度脂蛋白含量和低密度脂蛋白含量显著(P < 0.05)降低，球蛋白含量极显著(P < 0.01)和IgA含量显著(P < 0.05)升高(表 3)。酶联法测定IgE、IgA、IgM和IgG的含量，结果显示试验组中的IgE和IgM的含量极显著(P < 0.01)升高，IgA显著(P < 0.05)升高(表 4)。说明饲喂酵母菌和乳酸菌发酵提取物对闽东山羊部分血清生化指标和免疫球蛋白有显著的影响，能够提高机体的免疫力和保健功能。
表 3 不同处理对闽东山羊血清生化指标的影响Table 3. Effects of treatment diet on serum biochemical indicators of Mindong goats项目 对照组 试验组 总蛋白/(g·L-1) 70.57±2.13 69.65±5.96 白蛋白/(g·L-1) 28.42±2.33A 21.7±3.78B 球蛋白/(g·L-1) 42.15±3.28B 47.97±3.47A 白蛋白/球蛋白 0.68±0.09A 0.45±0.07B IgM/(g·L-1) 0.03±0.01 0.03±0.01 IgG/(g·L-1) 0.02±0.01 0.02±0.00 IgA/(g·L-1) 0.03±0.04b 0.10±0.00a 谷氨酰转肽酶/(U·L-1) 34.28±11.69 37.63±5.19 碱性磷酸酶/(U·L-1) 220.53±100.20A 74.73±19.15B 谷丙转氨酶/(U·L-1) 46.32±5.21a 37.17±7.09b 谷草转氨酶/(U·L-1) 101.52±20.37 109.35±13.89 谷草转氨酶/谷丙转氨酶 2.24±0.62 3.04±0.75 肌酸激酶/(U·L-1) 399.00±161.12 443.17±119.86 乳酸脱氢酶/(U·L-1) 302.45±52.03 263.65±10.82 总胆固醇/(mmol·L-1) 4.34±2.66a 2.12±0.67b 甘油三酯/(mmol·L-1) 0.21±0.12 0.18±0.07 高密度脂蛋白/(mmol·L-1) 1.78±0.49a 1.25±0.25b 低密度脂蛋白/(mmol·L-1) 2.47±2.22a 0.79±0.44b 表 4 不同处理对闽东山羊免疫球蛋白的影响Table 4. Effect of treatment diet on immunoglobulin in Mindong goats项目 对照组 试验组 IgE/(μg·L-1) 86.34±2.30B 107.49±2.16A IgA/(μg·L-1) 113.59±2.38b 121.99±3.09a IgM/(μg·L-1) 13.75±0.40B 20.18±0.39A IgG/(μg·L-1) 1253.20±32.89 1288.62±36.52 3. 讨论与结论
本试验结果表明，饲喂酵母菌和乳酸菌发酵提取混合物30 d后，能够提高闽东山羊的日增重。关于酵母培养物和乳酸菌发酵产物在羊饲粮中的应用目前未见报道，在鸡和猪的饲粮中的应用试验结果不尽相同。Park等[11]报道，在肉鸡中添加乳酸菌发酵产物能够提高肉鸡的生产性能。马明颖等[12]报道，在蛋雏鸡日粮中添加0.3%的酵母培养物具有增强雏鸡生产性能的功效。在肉鸡饲粮中添加2%的酵母培养物可促进其生长，而添加4%的酵母培养物后严重影响其生长速度[12]。原因可能是菌株不容，发酵产物中一些有效活性成分和剂量不尽相同，从而对畜体生产性能的影响不同。另外，一些不可测定的因素，如应激、饲粮营养不足或亚临床疾病等可能影响酵母菌和乳酸菌提取混合物对动物生产性能的效果。
本研究结果显示，饲喂酵母菌和乳酸菌提取混合物降低了闽东山羊血清中的白蛋白含量、白球比、碱性磷酸酶含量、谷丙转氨酶含量、总胆固醇含量、高密度脂蛋白含量和低密度脂蛋白含量，升高了闽东山羊血清中球蛋白含量和IgA含量。酶联法测定结果还表明，饲喂酵母菌和乳酸菌提取混合物提高了闽东山羊血清中IgE、IgA和IgM的含量。血清中球蛋白含量的提高，特别是IgE、IgA和IgM含量的提高，说明酵母菌和乳酸菌发酵产物能够促进机体球蛋白，特别是免疫球蛋白的提高，能够通过提高血清中球蛋白的水平来增加机体的免疫能力。同时碱性磷酸酶和谷丙转氨酶含量的显著变化再次说明酵母菌和乳酸菌发酵产物能够影响碱性磷酸酶和谷丙转氨酶水平，从而影响机体蛋白质合成代谢和分解代谢，说明酵母菌和乳酸菌的发酵产物能够提高闽东山羊机体蛋白的代谢率。这与刘敏等[13]研究大蒜素对哈萨克羊血清生化指标的影响结果相似。
微生物在代谢活动所产生的自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等，不同种类的微生物产生的初级代谢产物的种类基本相同[14]。其生长到一定阶段后产生的具有十分复杂的化学结构、对该菌株无明显生理功能，或并非是其生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等，不同种类的微生物所产生的次级代谢产物不相同[15]。这些代谢产物在动物机体中参与了复杂的机体生长代谢[16-17]，目前影响血清中生化指标的具体成分尚不清楚[18-19]，有待于进一步研究。
因此，本研究结论如下：
(1) 酵母菌和乳酸菌发酵产物可提高闽东山羊的生产性能；(2)酵母菌和乳酸菌发酵产物可通过显著降低血清中碱性磷酸酶和谷丙转氨酶的水平来提高闽东山羊机体蛋白的代谢效率；(3)酵母菌和乳酸菌发酵产物可通过显著提高血清中球蛋白的水平和免疫球蛋白水平来增强机体的免疫能力。
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