禽1型副黏病毒(Avian Paramyxovirus type 1,APMV-1)又被称为新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)，是禽类最为重要的烈性传染性病病原之一^[1]。尽管目前所有的APMV-1分离株均为同一个血清型，但不同分离毒株存在显著的遗传差异性，其病毒基因型复杂，不同基因型病毒之间的抗原交叉保护较低，且在家禽中存在多种基因型病毒共流行的状况，尤其是在20世纪90年代后期水禽(鸭、鹅，特别是雏鸭、雏鹅)感染APMV-1发病死亡病例的不断出现，表明该病毒在自然选择压力和疫苗免疫压力作用下出现了新的适应性突变，进而引起了病毒的易感宿主谱、传播特性及致病性等生物学特性的改变，这些变异严重影响了该病的流行病学监测和有效防控^{[2, 3]}。为明确我国蛋鸭感染该病毒的情况及禽1型副黏病毒对蛋鸭致病性等相关生物学特性，本课题组自2011年起，对我国蛋鸭主产区开展了蛋鸭禽1型副黏病毒感染的流行病学调查、病毒致病性测定等，为今后我国蛋鸭禽1型副黏病毒病的防控提供科学依据和技术支撑。

供试鸭胚，购自福建省莆田广东温氏家禽有限公司；自非疫区购进3 d雏麻鸭220羽、170 d开产麻鸭160只，且经采血检测为鸭副黏病毒抗体阴性；鸡新城疫参考强毒株F48E9(基因Ⅸ型)购自中国兽药监察所，2株分离株鸭源禽1型副黏病毒FP1株(基因Ⅶ型)和XBT14株(基因Ⅸ型)由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定与保存；pMD 18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司；宿主菌DH5α由福建省禽病防治重点实验室保存；Trizol购自Invitrogen公司，M-MLV Reverse Transcriptase购自Promega公司，Ex Taq DNA聚合酶，dNTP Mixture、DNA marker DL2000购自宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖为TRANS公司产品；其他试剂为国产分析纯。

自2011年以来，对我国蛋鸭主产区——福建、浙江、江西、广东、广西和江苏六省(区)的蛋鸭在不同季节开展了禽1型副黏病毒感染的临床流行病学调查，并采集蛋鸭组织样品495份，-80℃低温保存备用。

采集495份蛋鸭组织样品，在无菌条件下以无菌PBS缓冲液(pH7.4)按常规方法匀浆后，反复冻融3次，离心后取上清用于病毒核酸的提取，病毒核酸的提取步骤参照文献[4]，提取的核酸应在2 h进行RT-PCR扩增或反转录成cDNA保存于-70℃冰箱备用。

禽1型副黏病毒鉴定引物参照文献[4]设计，引物如表 1，引物扩增片段大小：强毒株能扩增出350 bp和535 bp大小的2个目的片段，低毒力株核能扩增出201 bp和535 bp大小的2个目的片段；禽1型副黏病毒通用引物能扩增大小为535 bp的片段。检测方法参照文献[4, 5]，具体为PCR反应体系均50 μL： PCR Master Mix(2X)25 μL，引物各1 μL，模板2 μL，用水补充体积至50 μL，反应条件如下：94℃预变性5 min，按94℃ 20 s、53~68℃ 20 s、72℃ 1 min进行35个循环，最后72℃延伸10 min结束反应，取产物5 μL经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

表 1(Table 1)

表 1 禽1型副黏病毒RT-PCR引物Table 1 Primers of AMPV-1 引物名称 引物序列 强毒株上游引物F1 5′-ATGGGCYCCARAYCTTCTAC-3′ 强毒株下游引物R1 5′-AGCGTYTTTGTCTCCT-3′ 弱毒株上游引物F2 5′-GGGGARACAGGGDCGYC-3′ 弱毒株下游引物R2 5′-CTGCCACTGMTAGTTGTGATAATCC-3′ 禽1型副黏病毒通用引物上游引物F 5′-ATGGGCYCCARAYCTTCTAC-3′ 禽1型副黏病毒通用引物下游引物R 5′-CTGCCACTGMTAGTTGTGATAATCC-3′ 注：序列中含有的简并碱基D=A/T/G,Y=C/T,R=A/G,M=A/C。

表 1 禽1型副黏病毒RT-PCR引物 Table 1 Primers of AMPV-1

对220羽3d雏麻鸭饲养到7、14、21 d时，从中随机任取45羽分为3组、每组15羽，分别肌注鸭源禽1型副黏病毒FP1株(基因Ⅶ型)、鸭源禽1型副黏病毒XBT14株(基因Ⅸ型)和鸡新城疫F48E9参考强毒株(基因Ⅸ型)0.5 mL·羽(病毒接种量均为5×10⁸ELD₅₀)；同时，设对照组雏麻鸭15羽，肌注等量无菌PBS缓冲液。对各组鸭隔离饲养，每天观察4次、连续观察14 d，并记录每组鸭发病情况、临床症状及病变等。

对160只170 d开产麻鸭饲养到185 d时，从中随机任取105羽分为3组、每组35羽，分别肌注鸭源禽1型副黏病毒FP1株(基因Ⅶ型)、鸭源禽1型副黏病毒XBT14株(基因Ⅸ型)和鸡新城疫F48E9参考强毒株(基因Ⅸ型)0.5 mL·羽(病毒接种量均为5×10⁸ELD₅₀)；同时，设对照组麻鸭35羽，肌注等量无菌PBS缓冲液。对各组鸭隔离饲养，每天观察4次、连续观察14 d，并记录每组鸭发病情况、产蛋量、临床症状及病变等。

强毒株能扩增出350 bp和535 bp大小的2个目的片段，低毒力株核能扩增出201 bp和535 bp大小的2个目的片段；禽1型副黏病毒通用引物能扩增大小为535 bp的片段，与预期结果相符(图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 RT-PCR检测结果 Fig. 1 Results of RT-PCR 注：1为DNA分子量标尺；2为强毒株；3为低毒力株；4为强毒株、低毒力株混合物；5为阴性对照。

2011年以来，从福建、浙江、江西、广东和广西等蛋鸭养殖区采集了疑似感染禽1型副黏病毒495份样品，应用已建立的RT-PCR方法进行检测，结果共检出46份阳性，阳性率为9.3%(表 2)，其中以福建省蛋鸭的感染阳性率最高，达10.7%，其次是江西省蛋鸭，阳性率最低的为广西蛋鸭，阳性感染率仅为3.4%(表 2、图 2)。

表 2(Table 2)

表 2 六省(区)蛋鸭样品禽1型副黏病毒感染的检测结果Table 2 APMV-1 infection on egg-laying ducks from 6 provinces 地区 样品数 阳性数 阳性率 /% 福建 148 17 10.7 浙江 101 12 9.6 江西 87 9 10.3 广西 29 1 3.4 广东 61 4 6.6 江苏 35 4 8.6 总计 495 46 9.3

表 2 六省(区)蛋鸭样品禽1型副黏病毒感染的检测结果 Table 2 APMV-1 infection on egg-laying ducks from 6 provinces

图 2(Fig. 2)

图 2 我国六省(区)蛋鸭感染禽1型副黏病毒的阳性率 Fig. 2 Positive rates of APMV-1 infection on egg-laying ducks from 6 provinces

所采集的495份蛋鸭样品中，按春、夏、秋、冬四个季节区分分别为121、78、91、205份，应用已建立的RT-PCR方法进行检测，结果其阳性率分别为9.1%、3.8%、5.5%和13.2%，其中以冬季采集的样品禽1型副黏病毒阳性检出率最高(表 3)。

表 3(Table 3)

表 3 不同季节蛋鸭样品禽1型副黏病毒感染检测结果Table 3 APMV-1 infections on egg-laying ducks in different seasons 季节 样品数 阳性数 阳性率 /% 春季 121 11 9.1 夏季 78 3 3.8 秋季 91 5 5.5 冬季 205 27 13.2 总计 495 46 9.3

表 3 不同季节蛋鸭样品禽1型副黏病毒感染检测结果 Table 3 APMV-1 infections on egg-laying ducks in different seasons

经试验测定FP1株基因Ⅶ型鸭源禽1型副黏病毒对7、14、21、185 d麻鸭的致死率分别为73.3%(11/15)、53.3%(8/15)、20%(3/15)、0，Xbt14株基因Ⅸ型鸭源禽1型副黏病毒对7、14、21、185 d麻鸭的致死率分别为53.3%(8/15)、26.7%(4/15)、6.7%(1/15)、0，可见基因Ⅶ型鸭源禽1型副黏病毒对麻鸭的致死率高于基因Ⅸ型鸭源禽1型副黏病毒，且呈现日龄的易感性差异，即随着麻鸭日龄的增长其致死率明显降低，但可引起开产麻鸭产蛋率明显下降，分别降低到20%、37%，与对照组83%的产蛋率相比产蛋率分别下降了63%和46%(表 4)。

表 4(Table 4)

表 4 鸭源不同基因型禽1型副黏病毒对不同日龄麻鸭的致病性结果Table 4 Pathogenicity of APMV-1 of different genotypes on egg-laying ducks of various ages 毒株名称 基因型 攻毒量 (ELD50) 对不同日龄(d)麻鸭的致死率/% 7 14 21 185 FP1株 Ⅶ型 5×108 73.3 53.3 20 0，产蛋率降至20% XBT14株 Ⅸ型 5×108 53.3 26.7 6.7 0，产蛋率降至37% F48E9株 Ⅸ型 5×108 86.7 46.7 26.7 0，产蛋率降至23% 对照组 无菌PBS 0 0 0 0，产蛋率83%

表 4 鸭源不同基因型禽1型副黏病毒对不同日龄麻鸭的致病性结果 Table 4 Pathogenicity of APMV-1 of different genotypes on egg-laying ducks of various ages

经测定，鸡源F48E9株对7、14、21、185 d麻鸭的致死率的致病率分别为86.7%(13/15)、46.7%(7/15)、26.7%(4/15)、0，也呈现日龄的易感性差异，即随着麻鸭日龄的增长其致死率明显降低，但可引起开产麻鸭产蛋率明显下降，降低到23%，与对照组83%的产蛋率相比产蛋率分别下降了60%(表 4)。

禽1型副黏病毒属于副黏病毒科副黏病毒亚科的腮腺炎病毒属，代表毒株为新城疫病毒，是危害我国养禽业的主要病原之一。据报道，该病毒的感染谱很广，主要有鸡、火鸡，且鸬鹚^[6]、鹅^{[7, 8]}、鸭^{[9, 10, 11, 12, 13]}、企鹅^{[14, 15]}等水禽不再只是隐性感染宿主和病毒贮存库，而是成为禽1型副黏病毒的易感禽类。因此本研究监测了2011年以来的福建、浙江、江西、广东和广西等蛋鸭感染禽1型副黏病毒的情况，所监测省份的蛋鸭感染禽1型副黏病毒的阳性率高低不一，其中以福建省蛋鸭的感染阳性率最高，其次是江西省，阳性率最低的是广西蛋鸭；通过对不同季节临床样品禽1型副黏病毒感染的检测，发现冬春季节感染率更高，这揭示我国蛋鸭群存在不同程度的禽1型副黏病毒感染。

为了进一步深入地研究不同基因型和不同源禽1型副黏病毒的生物学特性，本研究探讨了3株不同基因型和不同源同一基因型禽1型副黏病毒的致病性。结果表明基因Ⅶ型鸭源禽1型副黏病毒对麻鸭的致死率高于基因Ⅸ型鸭源禽1型副黏病毒，且呈现日龄易感性差异，即随着麻鸭日龄的增长致死率降低；另外对开产麻鸭可明显降低产蛋率(产蛋率从83%降低到20%或37%)；不同源同一基因型禽1型副黏病毒对蛋鸭的致病性，与不同基因型禽1型副黏病毒对蛋鸭的致病性规律相似；不同源同一基因型禽1型副黏病毒都会导致开产麻鸭产蛋率明显降低，鸡源禽1型副黏病毒Ⅸ型可使麻鸭产蛋率降低60%，为今后制定鸭病防控提供科学依据。